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使用傅立叶变换红外光谱法定量测定全血中的葡萄糖浓度

摘要：

傅里叶变换红外透射光谱已经用于测定来自28个患者的全血样品中的葡萄糖浓度。使用光谱范围950-1200cm -1的4-向量偏最小二乘法校准模型产生独立测试集的0.59mM的标准误差预测。对于来自单个患者的血液样品，我们发现葡萄糖浓度与在1082cm -1和1093cm -1处的二阶导数光谱的值之间的差异成比例。这种光谱学可以单独的使用特定的波数来测定来自单个患者的血浆样品中的葡萄糖浓度，预测误差为0.95mM。

一．引言

血液中葡萄糖的定量是临床分析中一个持续的研究领域。血液中葡萄糖浓度的测定对于糖尿病的治疗和控制是至关重要的（Shamoon等1993，Nathan 1996），对关键病房患者的监测，特别是在特殊护理新生儿单位的早产儿。 由于许多潜在的优点，红外（IR）光谱学已经吸引了对血液和血清研究的许多关注：不需要试剂，可以从单个光谱确定多于一种分析物的浓度，并且该方法适合于自动化.（霍尔和波拉德，1992年，哈森等人，1998，肖和Mantsch 2000年, 海泽和比特，1997年，哈兰等人1992年，哈利勒1999，阿诺德1996，海泽等人1989，波拉德等人1993，Ward等1992）

以前的研究已经表明，傅立叶变换红外光谱（FTIR）可用于在中红外范围内测定血液中的葡萄糖。已经对液体样品采用了衰减全反射（ATR）技术，其与偏最小二乘法（PLS）校准模型组合产生了在0.8-1.1mM范围内的标准误差预测（海泽等人1989，波拉德等人1993，Ward等人1992）。然而，蛋白质在ATR晶体上的吸收是该技术的缺点。 因此，在另一种方法中，将血液或血清样品沉积在聚乙烯卡片或IR-窗口基底上并干燥以消除水的吸收。 对于血清中的葡萄糖和对于血液中的葡萄糖，所获得的标准误差预测值为0.41mM（Budinova等人1997，Shaw等人1998）。 在这些测量中，将硫氰酸钾加入到血液或血清样品中作为内部参考以补偿膜厚度和样品量的变化。

由于其粘度和高颗粒含量（全血含有约45％的细胞组分），以及高水分背景吸收，中红外透射测量长期以来被认为是用于全血分析差的技术。 然而，尽管有这些问题，使用FTIR透射光谱法对全血中的葡萄糖进行直接测定。

在本文中，我们从28名患者的全血样本中葡萄糖浓度的定量测定来提供详细的结果表明使用FTIR透射光谱和PLS校准模型的效果。我们讨论了PLS模型中光谱范围和矢量数量对预测精度的影响。 此外，我们得知葡萄糖浓度可以直接从两个特定波长透射光谱的二阶导数确定，这可能有利于该技术的实际实施。 二．实验细节

通过用去离子水适当稀释预制备的32g / dl D-葡萄糖溶液，将葡萄糖水溶液样品制备成各种浓度。 所使用的血液样品取自常规临床预约的28名匿名患者。 将这些静脉全血样品直接收集到氟化物/ EDTA管（氟化物抑制糖酵解和EDTA作为抗凝血剂）中，并在测量前在4℃冷藏储存。从接收到实验室的2小时内，通过实验室参考方法（Dade Behring Dimension 尺寸分析仪）直接分配新孔样品的葡萄糖浓度，发现其范围为2.4至29.0毫米。 该临床方法在5.0mM和20mM的葡萄糖水平下的一批内的变异系数小于2％。

所有透射光谱用配备有Ge / KBr分束器和液氮冷却的汞 - 碲化镉（MCT-316）检测器的Bruker IFS113V光谱仪记录。 整个使用具有KRS-5窗口和25μm特氟隆间隔物的液体池（池体积10μl）。 对于全血测量，首先使用注射器（1ml）将500μl样品通过液体细胞冲洗。

在测量之后，用1毫升去离子水在相反方向上清洁液体电池。 在所有FTIR红外光谱测量期间，样品的温度保持恒定（22±2℃），以使由于温度变化的光谱变化最小化。 在500cm -1至7000cm -1（4cm -1分辨率，四点变迹和零填充因子为2）的光谱区域中进行三十二次扫描用于数据采集。 在用于进一步的数据分析之前，使所有光谱用标准Savitzky-Golay方法（13个平滑点）测量

三.结果与讨论

图一水性葡萄糖样品（60mM）及其相应的二次衍生物的测量（空心圆）和模拟（实线）FTIR透射光谱。

3.1 葡萄糖水样品

图1显示了在950-1200cm -1光谱范围内60mM含水葡萄糖样品的FTIR透射光谱，归一化为去离子水谱。 在这个光谱范围内的吸收特征主要是由于CC和CO拉伸模式以及OCH，COH和CCH基团的变形（Buslov等人1999，Kacurakova和Mathlouthi 1996）。 图1还表示出了洛伦兹振荡器模型的结果，其使用八个振荡器的和来在该光谱范围上模拟葡萄糖光学吸收系数α

其中Vj和Гj和Sj是中心波数（单位是cm-1）,线宽（单位是cm-1），振子强度。分别的，ε00表示电子对复介电常数的贡献. 测量和模拟吸收光谱的二阶导数也呈现在图1中; 由于消除了基线和斜率中的随机波动，可以在二阶导数光谱之间观察到更好的一致性，并且可以缩小和增强光谱特征。 然而，具有高信噪比的的原始FTIR光谱对于避免噪声的增强是必要的。

图二，FTIR透射光谱（归一化为去离子水谱）和水性葡萄糖样品的二阶导数光谱。 为了清楚起见，绘制了9个光谱中的4个，样品浓度为1.8,3.6,5.3和8.0mM。 具有最大峰值（在1082cm -1处）的二阶导数谱对应于具有最高葡萄糖浓度的样品。图2显示了用浓度范围为1.0-8.0mM制备的四种水性葡萄糖样品的归一化FTIR光谱以及归一化光谱的二阶导数。 由于这些样品的浓度低，原始透射光谱中的吸收特征较弱，并且埋在基线和光谱斜率中的随机波动中。然而，通过与从更浓的水性样品获取的光谱进行比较来验证，在获取二次导数后显示所有葡萄糖吸收峰。 使用多变量偏最小二乘法（PLS）校准模型（Martens和Naes 1991，Beebe和Kowalski 1987）来确定葡萄糖浓度，使用归一化光谱的二阶导数作为评价的基础。 对于校准模型的评估，我们使用标准误差校准（SEC）和标准误差误差（SEP）。通过这些值计算

其中C i和C 0i分别是校准集的第i个样本的预测和真实浓度，T i和T 0i分别是测试集的第i个样本的预测和真实浓度。 N C和N T是校准和测试样品的数量。 我们研究了不同

的多元校准模型，改变所使用的PLS矢量的数量，光谱范围和数据预处理步骤（Martens和Naes 1991，Beebe和Kowalski 1987）。 基于在950-1200cm -1范围内的二阶导数IR光谱，确定向量的最佳数目为4

将PLS模型应用于校准组（图2所示）和独立测试组（在另外九个水性葡萄糖样品上进行另一组FTIR测量）。 计算校准组的SEC和测试组的SEP分别为0.01mM和0.15mM; 这个SEP与用于测定血液中葡萄糖的标准临床方法的可比性（Petibois等人2001）。 为了检查已建立的PLS模型在更复杂系统上的功效，制备并研究了7种混合糖水样品，每种糖样品包含具有恒定葡萄糖浓度（7.0mM）的不同果糖浓度（在3-22mM的范围内）。

图三 全血和去离子水的FTIR透射光谱。 血液来自患有葡萄糖浓度为20.1mM的患者10。

选择果糖，因为它具有与葡萄糖相似的分子结构，因此具有相似的吸收特征。 预测的浓度具有6.7mM的平均值，SEP值为0.3mM，与制备的浓度非常一致。 这表明即使在可能的干扰分析物例如果糖的存在下，模型也可以量化葡萄糖浓度。

这些结果表明，FTIR光谱具有测定水性葡萄糖样品中葡萄糖浓度所需的灵敏度和选择性。

3.2 全血样本

对从28名具有2.4-29.0mM范围内的葡萄糖浓度的匿名患者中获得的全血样品进行FTIR光谱测量。 图3显示了全血样品的典型FTIR透射光谱，与去离子水的光谱相比较。 在900-1600cm -1的光谱范围内，全血的透射率约为水的透射率的40％。此外，可以在血液谱中鉴定许多吸收特征，特别是对应于蛋白偶联的N-H弯曲振动模式和C-N伸缩振动模式的酰胺II吸收范围（1480-1580cm -1）。 然而，950和1200 cm -1之间的葡萄糖吸收特征与源自其他血液成分的光谱特征重叠（Shaw等1998）。

在所研究的28个患者中，14个随机选择的血液谱用作校准集，其余作为测试集。 采用上面讨论的4-矢量PLS校准模型。 尽管高吸水性背景和复杂的血液基质，参考数据和FTIR数据非常一致，如表1所示。校准集的SEC和测试集的SEP计算为0.46mM和0.59mM 这是在血液中测定葡萄糖的最佳结果之一（Heise等人1989，Bhandare等人1993，Ward等人1992，Budinova等人1997，Shaw等人1998，Vonach等人1998）。使用透射FTIR光谱和掺杂程序（向全血添加葡萄糖以获得期望的葡萄糖浓度的样品），Vonach等（1998）在测定血肌谱病患中的葡萄糖浓度时获得0.81mM的SEP。 相反，在我们的工作中，每个血液样品来自不同的患者，因此具有不同的血液基质。 这两项研究表明，IR透射测量是确定2.4-29mM的临床相关浓度范围中的葡萄糖浓度的方便和精确的工具。 此外，该技术具有优于ATR和干血膜方法的优点，因为既不需要试剂也不需要样品制备（Vonach等1998）。

3.4偏最小二乘校正模型的光谱范围

为了理解限制全血中葡萄糖测定的潜在因素，我们通过改变光谱范围和使用的PLS载体的数目，评估了许多不同的多变量PLS模型。 选择三个光谱范围（980-1010cm -1，1015-1045cm -1和1070-1100cm -1），因为在这些频率的吸收特征主导水性葡萄糖样品的二阶导数光谱。 水性葡萄糖和全血样品的结果总结在表2中。

对于水性葡萄糖样品，1070-1100cm -1光谱范围提供了最好的预测结果。 这是因为在1082cm -1处的吸收峰具有较窄的线宽，并且也是二阶导数光谱中的最大峰。 由于没有来自其他分析物的干扰，SEP由FTIR光谱仪的性能决定。 然而，对于全血样品，基于1070-1100cm -1范围的PLS模型给出大约的SEP，大约是含水葡萄糖样品的5倍。这是因为其他血液分析物对该范围内的光谱有显着贡献。 然而，基于1015-1045cm -1的PLS模型提