内容发布更新时间 : 2024/5/2 8:01:31星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

使用oligo dT引物扩增的产物, 可以保证扩增产物包括mRNA的3'末端(减少rRNA的干扰), 但是oligo dT primer扩增有一个问题, 就是扩增片段的长度和扩增产物所包含的信息量的问题, 之所以有长度这个问题,一方面和lz所提到的RNA完整性有关,但最重要的限制在于逆转录酶的延伸能力. 用oligo dT primer扩增可能出现扩增出来的片段长度短, 虽然都有mRNA的3'端, 但是序列信息多位于3'-UTR附近, 若扩增序列太短,则有用信息很少, 不利于序列的识别和分析.

使用random primer, 也有片段长度的限制, 但是由于它的逆转录并不一定在mRNA的末端起始, 而是在随机位置起始,所以它的扩增片段带有更多CDS的信息.但是如果是用总RNA逆转录的话,有可能会受到rRNA的干扰.

至于Gsp,只是在扩增已知gene/gene family以及部分原理的RACE中使用.

用随机引物时 要去除总RNA中的tRNA rRNA, 只保留mRNA

如果接下来你的PCR产物是外显子，就用oligo dT; 如果是内含子或者包括部分内含子，就用random

mRNA反转录之后的cDNA为模板进行PCR，不都是外显子吗？内含子在这之前都被剪切掉了。所以不知道“内含子...”这句话是什么意思，或者有其他的含义，求解！

如果你想要做蛋白表达，就用Oligo dT，要是你做的基因包括内含子就用随机引物喽。

我最近在用逆转cDNA为模板扩增CDS序列（3000bp左右），同时用oligodT和random引物逆转，结果大多数时候两者扩增效果是一样的，少部分情况只有random能扩出目的带，尤其是中间段和靠近5?端的CDS区——这结果基本和网上很多资料相吻合——比如随机引物更适合CDS长的、有二级结构的基因。

显然是选random primer更好，其实说明书是有写的啦，原因是RT-PCR逆转录是要得到一个所有的RNA的cDNA库，然后再P出你要的“几个基因”，所以不是每个基因的mRNA都是有polyA的，很多都是没有的，microRNA，piRNA，很多都没有哦，所以如果你用oligo dT引物，就自然会miss掉很多（确实是很多）的RNA，而随机引物不会有这个问题，用它反转录出来的cDNA丰度更高，结果更加准确

看你的目的基因的mRNA有没有polyA尾巴 有的话就用oligodT 没有的话就用随机引物

一般在反转录的时候除了引用特异性引物和oligodT作为反转录得到第一条cDNA链外，运用随机引物的效果也很好，随机引物一般有6-10碱基的寡核苷酸引物，引物的序列是随机的，也就是说随机引物是各种引物的混合物，随机序列的肯能性很多，由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的 CDNA；现在随机引物已经商品化， 没有必要自己合成，直接购买就可以，Takara公司就有，我用的挺好的，有两种： pd(N)6 -含有6个碱基的随机序列； pd(N)9-含有9个碱基的随机序列，我用的是 pd(N)6。