内容发布更新时间 : 2024/4/24 5:46:24星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

不太好，做大蛋白（半干转仪也可以做大蛋白转膜，效率确实不如湿转，但抗体好、蛋白丰度一般时仍可采用）长时程（3hrs）转膜需要在4度冰柜或cold room进行；英国的产品，价格较高，公司不太出名国内不一定有代理，但质量和散热都非常好。

这里谈到了半干转和湿转。这两种转印方法各有优劣。湿转适合所有的蛋白，转膜效率最佳，但靡费试剂、溶液，对普通分子量大小的蛋白转染操作时间长于半干转（下文会具体给出条件）；半干转适合分子量较小的蛋白，省时、省试剂。蛋白分子大小如何界定呢？习惯上认为150KDa以上为大蛋白，其他均属于小蛋白，当然这只是一个相对标准。因此，通常对大蛋白的转印多数人会选择长时程的湿转，那么刚才提到的amersham半干转仪的缺陷实际上没太多实质意义，何况还可以外加条件弥补；而且用半干转做大蛋白转印本来就是高手在悬崖上跳舞，此时转膜效率是否更高已经没有任何意义——我说过转印效率对WB结果不起决定因素。

湿转、半干转缓冲液配方请参考分子克隆，有必要指出的是，实际上用半干转缓冲液进行湿转效果也非常理想，通常这种缓冲液可以反复使用多次（30V，～35V附近的时候，保险会自动跳掉、切断电转仪电源。至于UK的，即使整张大板胶室温电转3hr以后，最大电压仍为18V（因此足见其散热性能的优良）。注明：以上半干转仪时间的要求是针对PVDF膜的，这里面有一个很有趣的问题。尽管厂家一再表明PVDF膜比NC膜对蛋白的截留更高（但NC带负电性，理论上它的吸附量应该更高，所以通常同样使用TBST这种低盐洗液背景比PVDF膜高），但PVDF膜对小分子的截留明显不如NC膜，因此交联在预染marker上的颜料小分子很容易穿过PVDF膜，造成转膜过度的假象（除可考虑提升甲醇浓度至25%外，也可以考虑增加marker的上样量）；NC膜没有这种问题，所以通常它的转膜时间也是小蛋白1hr、大蛋白3hrs，电流控制在200-300mA（16cm*9cm大胶300mA，如果胶面积小很多可以考虑降低，实际上相当于2.5-3mA/cm2左右）。NC膜唯一不如PVDF膜的地方，在我看来是它的强度：干燥的膜易碎。当然目前某些厂家为解决这个问题，将NC成分涂在另一种介质的表面，这种膜的支持强度和PVDF膜类似，但转膜效率稍差于纯NC膜，且有明显的正反面；因此制作转印三明治的时候要特别注意正反面。此外，20KDa以下的蛋白宜采用0.22uM孔径的转印膜，但也不是一定必须。

对于大蛋白转印，很多书本建议采用低浓度胶，如6% SDS-PAGE。但实际操作发现，6%太软，制作转印三明治的操作非常麻烦；且内参如Actin、tubulin都在45KDa附近，而6%胶底边溴酚蓝指示60KDa左右，除非采用坛子上有人提过的灌不同浓度的胶或者梯度胶，否则需要同时跑两块胶，因此也不是很推荐。个人经验认为300KDa以下8%胶（底边36KDa）都可以胜任，可以适当调整选择7-8%胶可以兼顾内参和大蛋白。

转膜最好在低温进行（高温会局部溶胶或降低转膜效率），尽管很多半干转仪没有具体要求，但用预冷过的电转液湿滤纸比未预冷的转印效率更高。因此，有条件建议湿转、半干转均在低温（4度）进行。此外，湿转缓冲液可以考虑转印前-20度预冷，时间不能长于2hrs，否则电泳液冻结；mini3型有内置冰槽的，冰槽置-80度预冷。

制作转膜三明治的过程中，书中强调过滤纸、胶、膜的大小最好一致，否则没有胶、膜隔开部分的滤纸会因为直接接触而产生局部短路，降低内阻增加电（压）流，造成升温过快。但进口仪器随厂原包装附带的滤纸有限，如果每次都切割新滤纸，消耗过快、初次使用的膜转膜效率不高，且增加额外的操作。因此，实际上滤纸大一些也不太要紧，但是我会选择已

经切割好的和胶面积最接近的滤纸；通常膜的大小会严格控制在与胶面积一致或略小一点点。操作时在保证每一层均无气泡的前提下，叠好后再碾压几个来回，力道要均匀、恰好；力量过大，胶会被拉伸，条带会扭曲、变形。碾压的目的不是为了驱赶气泡（完全可以做到叠加的时候每一层都无任何气泡；诸如采用多层薄滤纸时可以一张张的叠加），更重要的作用是让膜和胶贴得更紧密。可以理解的是，对于蛋白分子的大小而言，胶和膜之间的间距是数十万倍计的，因此更紧密的接触无疑是转膜成败的关键。

胶和膜需不需要泡呢？不少公司实验讲座时提出泡胶、泡膜，实际操作中没有发现泡和不泡的转膜效率有多大差别。实际上，胶只需要在电转液中浸一下即可（可以减少与滤纸或者膜之间的气泡）；而膜也只要湿掉沾上电转液即可，同样多沾些缓冲液会有利于减少气泡（PVDF要先用甲醇湿润再投入缓冲液；NC直接进缓冲液）。

如何监控转膜的效率呢？

在早期，鄙人亦依据分子克隆的介绍，采用立春红染膜。只是后来发现此操作不仅增加额外的操作时间，而且不能说明任何问题，于是抛弃之。首先，立春红（也包括考染胶）的灵敏度和HRP-ECL体系的灵敏度相差太远，即使立春红染膜无颜色，也无法提示WB结果会不会失败（考染胶无颜色也不能说明转膜充分了，除非你银染），你仍然得继续后面的操作；相反靶蛋白区域有颜色，亦无法提示靶蛋白就转膜完全了，也许只是另外一个分子量大小相近的蛋白。因此，无论立春红染膜失败或成功，你都必须进行后续的操作。而立春红染胶不仅增加额外的操作时间，而且增加一轮漂洗的操作，对膜和膜上的蛋白都不好。那么为什么不采用更直观的预染marker做转膜监控的依据呢？理论上，同时转膜、颜色是交联到蛋白上的，因此颜色有多深表明有多少蛋白转印到膜上，非常直观、不会增加任何额外的操作（固定marker的上样量非常必要）。当然上面提到针对PVDF膜，由于对小分子截留的局限，颜料分子会在高强度的转印过程中从交联的蛋白上脱落并穿过膜（颜料与蛋白交联得过深会使整个lane糊掉；太紧（多）可改变蛋白构象使迁移率改变。所以多数情况下颜料和蛋白之间是一种不稳定的交联，这意味着在某些条件下，颜料会从交联的蛋白上脱落，又因为膜分子孔径以及膜对不同物质吸附能力的差异，颜料小分子会轻易穿过膜到滤纸背面，而蛋白则被牢固的截留在膜上），造成转膜过度的假象。现在你知道有这种局限，要么更换NC膜；要么采用上面提到的非常稳定的转膜条件、注意必要的细节，就可从根本上忽略掉其对转膜效率的指示，而把预染的marker仅仅作为一个分子量大小的指针，当然同时可确认之前的转膜操作无误（没有插反电极，放反膜），也可为后续抗体孵育操作时膜的正反面做必要的提示。

不同公司预染的marker效果不太相同，一般NEB和invitrogen的常规分子量预染marker要上8-10ul，MBI的只要5ul（胶大小20×30cm），Biorad－mini3型（8.2×7.4cm)MBI最低2.5ul转膜后就足够清晰。

抗体孵育——WB真正的难点：抗体的使用是一种艺术，一种抗体一个脾气。 对WB结果有决定性影响的因素是抗体的效价和如果正确使用手中的抗体。无论你如何提高自己的转膜技术，高效和低效之间往往只有数倍的差异，而抗体的效价可以差数千倍以上；同样，正确使用抗体可以保证抗体效价不被过分的拮抗，谋求特异性和非特异性背景之间差异的最大化。

封闭最短可以缩减到5min：

很多人把高背景或者黑板，认定为封闭不充分，其实这也是没有吃透WB（说实话，经

常看到坛子上很多人这样给人答疑，非常的无语）；实际上封闭（极端点）也是个可有可无的步骤，真正对降低背景起核心作用的是抗体稀释液中的组分。当你的抗体使用次数较多时，基本不用封闭也可以有较低的背景；如果抗体很新，其实封闭最短可以缩减到5min（没试过更短的，不一定不可以）。那什么导致高背景甚至黑板呢？抗体的质量不太好（主因），或者抗体稀释液的配方有问题（增大抗体稀释比略微有所改善）。封闭液的配方可以和抗体稀释液相同，也可以不同；通常封闭液是最简单（单方）的抗体稀释液，而抗体稀释液可能是复方。

封闭很少出状况。不过在milk做封闭剂的封闭液中，milk颗粒未完全溶解时，微小的颗粒会粘附在膜上增加星点状背景。

紧接封闭操作的是抗体孵育，之间不要用TBST漂洗。抗体孵育成败的关键首要在抗体本身的质量，包括抗体的效价和背景的强弱，然而历来商品化的抗体质量参差不齐。各家生产的抗体中质量问题最严重的是scbt的抗体，但它们的价格却是最便宜的。其实，scbt在美国的售后服务还是相当不错的，只要按他们的要求操作仍然能举证抗体的质量问题，可以更换、交换（你指定的他们销售的另外一种抗体），有时候还会附送一些ProA beads之类的，所以不奇怪它的普及率；也正因为此，如果你参考文献的话很容易找到这家公司的。可惜，在国内代理商不可能提供相应的服务，因此购买他们的商品存在不小的风险。所以，通常我更推荐sigma和Abcom、R&D等。诸如Sigma公司销售的Actin，cat. A5316，clone AC-74，Mab更是作为新手练习专用的抗体；它的背景很低，效价很高，可以1：30,000稀释（是普通一抗效价的30倍）。此外，尽管cell signaling是做磷酸化抗体起家的公司，但它们的抗体的质量总体感觉也不好，所以有其它公司可以选择时，我们会刻意避免购买cell signaling的产品，诸如Akt总抗和Ser473（这两种抗体R&D的产品效价不错）。

（特别注明：前几年CST的AKT抗体识别的条带在55KDa左右，而其他公司均认定为60KDa；最近还有战友提问这个抗体，重新检索了一下，应该是原AKT抗体（包括磷酸化）已经被CST自己下架了，从目前的几个抗体示意图看，大小也已与其他公司一致；因此，要不要买取决你自己）

抗体公司在出售抗体的时候，在广告上会玩很多花样。A.不给整张膜标记的图示。很多抗体质量不好，背景高杂带多，如果靶蛋白区域较干净时，他们通常只给很窄的一条靶蛋白区域的图例。B.不给内源性蛋白标记的图示，用IP的样品取代。通过IP可以富集抗原，减少杂蛋白，通常很容易拿到背景很干净，信号很强的图例。C.用制备抗体时高表达的多肽做阳性样品，不给全长蛋白的图例。由于多肽可以IP富集，且不存在空间折叠的问题（通常裸露在外），因此很容易标记。除以上花样外，不少抗体用途上还有局限，因此挑选抗体时要睁大眼睛。

此外，有一点值得注意的是，scbt销售的抗体表面上很多（通常1ml，而别的公司通常是200ul或者100ul），然而实际上它的浓度也仅为0.2λ，所以实际上他们抗体的质量也和其他公司的没区别都是200ug（常规）。所以在早期，我一直强调如果固定即用型一抗的浓度（稀释的一抗）为1ug/ml时，scbt的抗体最佳稀释比为1：200。不过近来发现，实际上他们的抗体1:2K稀释效价也不错，因此也许其他公司的一抗可以进一步提高稀释比。现在判断当时scbt抗体之所以采用1:200稀释，实际上是因为自制的ECL不够灵敏，所以建议用灵敏性更好的ECL，这样可以减少抗体的消耗量，进一步降低实验成本。

一抗通常4度过夜，效率较常温1-1.5hrs高；二抗通常1:5K稀释，室温0.5-1hr（过久并不会明显提高信号强度甚至会减弱（相当于洗膜），同时造成高背景进一步影响特异与非特异荧光信号强度间的对比。孵育时间过久还会迫使你延长TBST的时间，这对抗原识别能力较弱的抗体更致命）。洗膜通常用TBST，也可以考虑高盐洗膜液（NaCl 0.5M）；洗膜时间

一般10min*3或者5min*4。抗体孵育和洗膜时，摇床速度不能过快也不宜过慢，需要简单摸索一下。

聊完以上那些浅显的基本常识，接下来谈我认为最麻烦的： 首先，抗原抗体识别原理的物理学解释，抗体孵育过程实际上就是一个竞争结合的动力学过程。由于抗原和抗体特异性结合的效率是非特异性结合的数百万——数十亿倍，所以当特异性抗体与非特异性‘抗体’（不好描述，指添加在抗体稀释液中的封闭蛋白，我们可以把它们看成非特异性的一抗）竞争时，尽管抗体稀释液中封闭蛋白的浓度是一抗浓度20K：1以上，在碰撞几率相同的条件下，由于时间的积累加孵育过程中反复漂洗（孵育抗体要摇晃，对吧），特异性一抗积累了识别、结合优势。同样在TBST等漂洗的情况下，由于亲和力等原因，使得一抗很牢靠并进一步增加对比优势，再经过2抗特异性积累和ECL的最终放大形成特异性条带和非特异性背景之间荧光信号的巨大差异。

由以上碰撞结合、亲和力差异这些基本现象，我们可以解释WB中出现的现象。

1.在样品制备章节中，我强调PBS漂洗去培养基中BSA的作用。当时只描述了不漂洗的后果，是在BSA位置任何抗体都可以非特异性的结合从而显影。用碰撞的原理去解释：当杂带很浓的时候，抗体的特异性已经毫无意义，它只符合物理定律中的碰撞几率原理；因为你的杂带浓，碰撞几率大，粘附一抗的机会多，因此它就会显出来，但切记这是杂带。当杂蛋白含量高到一定程度，“任何”一种一抗都可以在该位置显出条带。

因此，用条带的深浅去判断是否是靶蛋白，这是非常不科学的。在默认抗体有效的情况下，如果抗原靠近区域没有杂带，背景干净，依据分子量大小可以初步确认靶蛋白的位置；如果有杂带，并不一定是特异性条带就比杂带亮，也许杂带蛋白浓度大，非特异性粘附的一抗更多。目前判断杂带和靶蛋白的唯一标准是分子量；而当分子量大小类似时，只有通过增加过表达或IP纯化的样品做阳性对照，或者KD该蛋白的样品做阴性对照一起电泳转膜，才能准确区分靶蛋白和杂质。（用IP或KD样品也是验证商品化抗体是否有效的可靠方案）

【补充2】：如何确定靶蛋白分子量？

由1的解释可知，杂带比靶蛋白荧光信号强且干净一点也不意外，而经常不同的公司对同一靶蛋白给出不同的分子量，那么如何确定新上手不熟悉的靶蛋白的分子量呢？

A. 用“过表达或IP纯化的样品做阳性对照”，这是最靠谱的方案。

B. 没有纯化蛋白做对照时，对一个蛋白的分子量判断一般有这样几步：

a.根据氨基酸长度自己预测，如300aa，分子量应为33KDa；以这个分子量为基准进行第二步。

b.去抗体公司网站search说明书。一般先不要有偏向性，google abcam、Sigma，R&D以及millipore或者其他的scbt，benthyl等等等等吧，很快你至少可以发现3家是一致或接近的（诸如52KDa，有的写54KDa，有的51KDa，这些都可以算作一样，因为表观分子量也是对应marker的相对估算，会有一点点差异；尤其当不同公司给的marker在靶蛋白区域上下差别很大时，比如，你的蛋白100KDa，有的公司在此区间的marker是180KDa直接jump到80KDa，有的可能中间多一条120KDa，那么这两种marker估算的表观分子量可能差10KDa以上——尤其蛋白较大时，胶浓度又不低，分离会不太好，一些距离的细微差异，在软件估算表观分子量时偏差可能很大；其他蛋白这类问题不多，因为通常商品化的marker在120KDa以下指示条带较为密集，而且一般浓度的胶对这些区段分离都很好，所以估算的表观分子量差别不大，如上述52KDa例子），那么最终的表观分子量基本就是你检索到的。如果和1中

一致，那么完全不用怀疑；如果不一致，有条件再用纯化的含标签的蛋白做验证，没有基本也可以follow多数意见——必须指出，很多抗体公司在具体到每一种抗体的说明书时常见虚假广告的嫌疑，“恁把杂带当靶蛋白”（最搞的情况是同一公司同一靶蛋白，可能有用不同区段制备的靶蛋白的抗体，而这几种抗体识别的靶蛋白分子量还很不一致），所以请follow多数意见。

C. 蛋白一般只可能因为修饰向上迁移，所以表观分子量比根据氨基酸长度计算值高常见；反过来，如果表观分子量比计算值还低，多半就是杂带；除非你的蛋白会降解，或者有的蛋白在ORF里面还有一个翻译起始位点。

经验之谈，对于不熟悉的蛋白，通常都要小心求证，尤其在开始阶段；有条件的话，换个抗其他区段的同一蛋白的抗体或者其他来源（Rab、Gab、Mab）同一蛋白的抗体标记试试，两种抗体能识别同一杂带的概率还是很小的，尤其不同来源的，因为此时二抗也要相应更换，几率更小。

2.WB结果白板（无信号）和黑板（高背景）。从抗体孵育角度解释白板和黑板问题（当然也可能与ECL显影有关，此点下一节有阐述），白板主要是可能是抗体本身效价不高，或者抗体稀释液中封闭蛋白过多，竞争结合时封闭蛋白完全挤掉了特异性的一抗，特异性条带和非特异性背景同样结合强度——无信号。黑板，也主要是因为抗体效价不高，而抗体稀释液中封闭蛋白的拮抗作用又没有完全发挥，此时无法有效识别抗原的一抗会等效的粘附转印膜的任何位置，显影后整张膜全黑。

有时候膜接近全黑，但可以若有如无的观察到靶蛋白，出现问题的原因虽然仍是抗体效价不高，封闭蛋白不能完全起到作用，不过此时可以通过改变抗体稀释液的配方，提高特异性和非特异性结合的信号差异，降低背景。

“这点非常重要”——当你的抗体标不到抗原时（白板），先弄出条带（黑板），再解决黑板（高背景）问题。第一步应该是通过倍比降低一抗的稀释比（从1:1K降到1:500到1:250到。。。；注：二抗稀释比不要轻易改变，增加二抗浓度对WB结果不会有太明显的改变），摸索到一个可以标出信号的条件。此时，由于一抗浓度过高，背景可能非常高，但背景的问题可以再调整，有没有特异性条带却没办法改变；实在没有靶蛋白的信号，只能更换别的公司生产的抗体。

那么如何通过改变抗体稀释液的配方，寻求抗体孵育的最佳条件呢？ 首先要认清，抗体稀释液没有一个绝对通用的配方；一种抗体一个脾气。 其次，抗体稀释液的配方要兼顾与特异性抗体竞争抗原的强度，以及对其他区域的封闭强度两方面的平衡。

目前，抗体稀释液中可以充当封闭蛋白的主要有milk，BSA和gelatin，似乎很少的样子 。。。可是，你有没有考虑过“复方”？——这下配方无限多了吧。

1. 采用milk，BSA和gelatin的单方。3% milk，5% BSA，<=0.4%的gelatin，并根据实际情况改变（若出现白板，请降低封闭剂浓度。；黑板多加）。gelatin大家可能比较陌生，不过如果你翻翻抗体公司卖给你的原装抗体里面液体的配方，你会发现很多抗体溶液里都有它。

2.很多情况下单方的浓度很高了，背景问题仍不能解决。那么请尝试两两或者三种不同比例混合。不过有些细节还是要自己摸索的，比如gelatin＋BSA时，gelatin浓度不能无限提高（会完全竞争掉抗原抗体特异性结合，导致白板），BSA的浓度较随意。

3.抗体稀释液可用低盐浓度的TBST，也可用高盐浓度的缓冲液（NaCl 0.5M）以降低背