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2010年 高等分子生物学
高级分子生物学
1.试述利用基因工程的技术调控基因表达的主要方法
原位杂交技术
原位杂交(In Situ Hybridization,ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。通常可以分为两大类：
1、RNA原位杂交：用放射性或非放射性(如地高辛、生物素等)标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可以通过检测放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物在细胞水平上作出定性定量分析；
2、荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)：首先对于寡核苷酸探针做特殊修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体的位置。
定点突变技术
定点突变是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。
RNAi技术
RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。其过程一般为：
1、在Dicer的参与下，细胞中的双链RNA首先被降解形成21-25个核苷酸的小片段双链RNA(siRNA)；
2、siRNA中的反义链指导合成一种被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的核蛋白体；
3、RISC再介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰基因表达的功能。
2.论述原核生物和真核生物基因表达调控的异同
答：1、真核生物基因组大,染色体数量多,且结构复杂,存在基因家族和断裂基因；原核生物基因组小,染色体数量少,结构简单,有重叠基因和操纵子结构，基因表达调控可以在复制、扩增、基因激活、转录、转录后、翻译和翻译后等多级水平上进行,但转录水平调控是主要的。真核生物基因表达调控机制发生在染色体活化、基因转录激活、转录后加工、翻译及翻译后加工等多水平的调节，事件也复杂的多。
2、真核生物基因表达以正调控为主，基因的转录与染色质的结构变化相关,真核基因转录发生在细胞核(线粒体基因的转录在线粒体内),需对内含子精确剪接加工，翻译则多在胞浆,两个过程是分开的。基因表达调控的环节比原核生物更多。原核生物中,营养条件和环境因素对基因表达调控起举足轻重的作用，mRNA在形成过程中与核糖体混合在一起，即转录和翻译过程相耦联。
3.简述α互补筛选（蓝白斑筛选）
适用于含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的载体，如 pUC系列等，其原理是：载体含有LacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点。当这种载体进入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞后（质粒和宿主细胞编码的片段各自都没有酶活性），它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫α互补。由α互补而产生的 Lac+ 细菌在呈色底物 X-gal
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和诱导剂IPTG存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无α互补能力的氨基端片段。因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。通过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析，即可确定这些质粒的结构。
4.简述菌落PCR筛选
该方法是以转化菌单个克隆为模板，采用特异性引物或通用引物对目的基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳等手段来鉴定筛选阳性转化子，最后可以经提取质粒DNA进行酶切和质粒PCR双重鉴定以及测序分析进一步确认菌落PCR的结果。
5.简述杂交探针技术的原理和方法
在制备好合适的基因文库后，如果用可获得目的基因的互补DNA或RNA做探针，就可以利用核酸杂交技术鉴定出特定的重组体克隆。
原理：任两条单链核酸分子都有相互形成碱基对的趋势，但形成的大多数分子对由于只有少数链间氢键形成，杂交结构并不稳定，如果多聚核苷酸链是互补的，碱基对的大量形成使双链分子稳定。
步骤：1、把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维膜上，处理除去杂质，只留下DNA，使DNA分子变性，双螺旋之间的氢键断裂
2、短时间的加热会使这些单链DNA分子牢固结合到膜上。DNA分子与膜结合其碱基是自
由的，可以自由配对。
3、然后把探针加上标签，加热变性，再加到适宜核酸退火的化学溶液中与膜结合。经过一
段时间，等杂交发生后，洗去没有结合的探针，干燥，检测结合的探针的位置，从而筛选出想要获得阳性克隆。
6.对天然质粒的人工构建、改造通常需要对质粒哪些方面进行操作、改进? 答：对于天然质粒应该做以下几方面的操作、改进：
1.删除一些非必要的区段及对宿主有不良影响的区段
2.削减载体的分子量，是载体具有更大的容纳外源片段的能力 3.加上易于选择或检测的标记，以便筛选出阳性克隆
4.限制性内切酶的酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体的特定位置 5.加上一些调控元件，有利于基因的表达
6.安全性改造（因为是简答题，以下四点可以不要，但建议最好要）:
（1）非传递性和不被带动转移。在基因工程操作中，不希望载体能够进行自主传递，也不希望被带动转移；
（2）具有条件致死突变。如温度敏感时就丧失复制能力，可防止克隆基因扩散，只存在于限定的宿主细胞中；
（3）一般情况下不希望与宿主染色体发生重组，因为重组后可能给宿主带来突变； （4）有较小的宿主范围。
7. 大肠杆菌乳糖操纵子的主要结构，调节机制。
答：大肠杆菌的乳糖操纵子（LAC操纵子）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β—半乳糖苷酶、透酶、乙酰基转移酶，此外还有一个操纵基因O、一个启动子P及一个调节基因I。I基因编码一种与O
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基因结合的阻遏蛋白，使操纵子受阻遏而处于转录失活状态。在P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白CAP结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成LAC操纵子的调控区，三个酶的编码基因由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。
调节机制：分阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。
1、阻遏蛋白的负调节：在没有乳糖存在时，I基因表达的乳糖阻遏蛋白与O序列结合，阻断转录启动；当有乳糖存在时，经透酶催化、转运进入细胞，再经原先存在于细胞中的少数β-半乳糖苷酶催化，转变为别乳糖，与阻遏蛋白结合，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录，使β-半乳糖苷酶分子急剧增加。
2、CAP的正调节：当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP与CAP结合，这时CAP结合在乳糖启动序列附近的CAP位点，可刺激RNA转录活性；当葡萄糖存在时，cAMP浓度降低，cAMP与CAP结合受阻，因此乳糖操纵子表达下降。
8. 试说明真核细胞与原核细胞在基因转录，翻译及DNA的空间结构方面存在的主要差异，表现在哪些方面？
比较原核、真核基因组异同
（1）染色体方面：原核生物为环状DNA分子，且DNA裸露或结合少量蛋白质，只有一个基因连锁群；真核生物为线性双链DNA分子，且DNA同组蛋白和非组蛋白结合，有2个以上基因连锁群。
（2）染色体遗传物质：原核生物为质粒，真核生物为细胞器基因组。
（3）转录单元：原核生物为多顺反子，真核生物为单顺反子，基因家族。 （4）DNA序列：原核生物无或很少有重复序列，真核生物有重复序列。
（5）基因表达：原核生物RNA和蛋白质在同一区间合成，有重叠基因；真核生物RNA在核中合成和加工，蛋白质在细胞中合成，有断裂基因。
比较原核、真核生物的转录过程异同 答：原核生物：
① 起始过程需RNA聚合酶核心酶，由σ亚基辨认起始点（-35bp区）。在这一区段酶与模板的结合松弛，酶移向-10区并跨入转录起始点。
②延长过程的核苷酸聚合仅需核心酶催化。
③终止分依赖ρ因子的和不依赖ρ因子的转录终止。 真核生物：
①转录起始前的-25bp区段有启动子的核心序列TATAbox。此外DNA分子上还具有其他可影响转录的顺式作用元件，以及能辨认和结合转录上游区段的反式作用因子。真核生物RNA聚合酶不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子。
②真核生物的转录延长过程与原核生物大致相似。
③真核生物mRNA有polyA尾结构，是转录后才加进去的。转录不是在polyA位置上终止，而是超过数百甚至上千核苷酸后才停顿。
比较原核、真核生物的翻译异同
1、原核生物与真核生物核蛋白体的组成不同。
2、真核生物肽链合成起始过程与原核生物相似但更复杂。真核生物有不同的翻译起始成分，起始因子
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