内容发布更新时间 : 2024/11/17 13:49:26星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

SDS-PAGE电泳标准操作规程

1、目的

建立SDS-PAGE电泳的标准操作规程,确保电泳操作有序进行，保证电泳的安全性、有效性。 2.范围与职责

适用SDS-PAGE电泳操作岗位。配制岗位操作人员对本标淮实施负责，QA检查员、生产主管负责监督。 3.程序： 3.1. 制胶

3.1.1组装胶架

将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。 3.1.2 分离胶的配置

3.1.2.1 10%分离胶配方如下表： 10%胶 蒸馏水 30?r-1.5M Bis(29:Tris-Hc1) 5 ml l PH 8.8 10%SDS 10%AP (过硫酸铵) TEMED 1.3 ml 1.7 ml 1.9 ml 0.05 ml 0.05 ml 0.007ml 3.1.2.2 灌胶

混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm)。 3.1．2.3液封

在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。

3.1.3浓缩胶的配置

3.1.3.1 5%浓缩胶配方下表： 5%胶 蒸馏30?r-Bis(29:1) 0.5M 水 Tris-Hcl PH 6.8 2 ml 1.4 0.33 ml ml 3.1.3.2插入制胶梳

混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。

3.2. 电泳

3.2.1 安装电泳槽

将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1X tris-gly电泳缓冲液。 3.2.2 样品处理

0.25ml 0.02 ml 10%SDS 10%AP TEMED (过硫酸铵) 0.02 ml 0.02 ml 对于蛋白样品直接取80μl的样品，依次加上20μl 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。 3.2.3 加样

用移液枪取处理过的样品溶液10μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。 3.2.4 电泳

将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。 3.2.5剥离胶

把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。 3.3. 染色

放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。 3.4.脱色

取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。 3.5.拍照