内容发布更新时间 : 2024/5/3 12:00:19星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

i. e., 8% for moi = 2.5.

To ensure 99% of cells are infected requires moi > 4.6.

Assume the conditions used for plaque assay and TCID assay don't alter the expression of infectious virus, TCID/ml and pfu/ml are related by pfu/ml = 0.7 * TCID.

As a working estimate, one can use pfu/ml = 0.5 * TCID.

50

5050

H5N1流感病毒TCID50（组织半数感染量）测定

一 生物材料与试剂

1.病毒与细胞

高致病性H5N1禽流感病毒A/Chicken/Yangzhou/35/2011（以下简称：YZ35） MDCK细胞 2.培养基

10%DMEM、无血无抗DMEM、1%DMEM 3.其他

96孔板、血凝板、PBS、1%的鸡红细胞

二 操作步骤

1. 细胞准备

取出一块96孔细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细胞消化后加10mL培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约70-90％丰度即可接种病毒（晚上传好板第二天早上就能用）。 2. 稀释待测病毒YZ35尿囊液

YZ35尿囊液用无血无抗的DMEM进行10倍倍比稀释，即向每支EP管中加入900μL无血无抗的DMEM，向1号试管中加入100μL病毒尿囊液，振荡混匀，再从1号管中取100μL稀释液依次10倍系列稀释至10-10。

注意：（1）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。（2）此过程中 需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器，并用紫外线照射20min， 确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）。 3.病毒稀释液接种细胞

取细胞培养板，用多道加样器（即排枪）吸去96孔板中的培养液，再吸取无血无抗DMEM加在每孔中再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100μL，每个稀释度做8个重复（即1竖排）。根据观察的习惯，一般从右到左，从上到下，从高稀释度到低稀释度加样。同时设置正常的细胞对照16孔（即2竖排）。

37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），加入1%DMEM维持液200μL继续在37℃ CO2培养箱中培养。

注意：低致病性流感病毒一般在胰酶存在的条件下才能感染MDCK细胞，因此病毒稀释液中需加入2μg/mlTPCK-胰酶。高致病性禽流感病毒在无胰酶存在条件下即可感染MDCK细胞，本次的病毒为高致病性H5N1，无须胰酶作用。 4.结果测定

接种病毒的细胞培养板在37℃CO2培养箱中培养72h后取出，比较对照观察不同稀释度的细胞病变（CPE），同时结合血凝实验进行综合判定，有细胞病变的判定阳性，无细胞病变的判定阴性，记录不同稀释度阳性和阴性孔数，用Reed-Muench法计算TCID50。

三 结果分析

假设统计结果如下表： 稀释度 阳性数目（1） 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 8 8 6 3 0 阴性数目 阳性总数 阴性总数 （2） 0 0 2 5 8 （3） 25 17 9 3 0 （4） 0 0 2 7 15 比率 （5） 25/25+0 17/17+0 9/9+2 3/7+3 0/15+0 阳性数百分比（6） 100 100 82 30 0 1．计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2） 2．计算阳性和阴性孔的累积数 （3）阳性孔总数累计由下向上累积 （4）阴性孔总数累积由上向下累积

3．计算阳性孔的百分比：比率（5）=（3）/[(3)+（4）]； 4. 阳性数百分比(6)=（5）×100% 5．计算距离比

距离比例=（大于50%的阳性百分比-50）/（大于50%的阳性比-小于50%的阳性百分比）=（82-50）/（82-30）=0.62

6.TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释对数+距离比例×稀释系数的对数=-3+0.62×（-1）=-3.62 注：稀释系数的对数

1:10稀释为-1；半对数稀释为-0.5； 1：5稀释为-0.7 7.则TCID50=10-3.62/100μL

表明该病毒（YZ35）尿囊液100μL进行10-3.62稀释可使半数组织发生病变。