内容发布更新时间 : 2024/12/23 14:15:03星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
人真皮三维重建及仿生人工真皮研制
背景:人类皮肤是由表皮层、真皮层和皮下组织组成的。皮肤厚度约为1到4毫米,约占了15%的总体重。
角质层的厚度约为10到15微米。它位于表皮的最外层,阻止水分丢失以及外来物质入侵。
毛囊、皮脂腺和汗腺是特殊化的表皮结构。它们主要位于真皮层和皮下组织,并且和表皮层相连。
真皮层由细胞、纤维成分(主要是胶原纤维和弹性纤维),以及大量基质成分组成。表皮和真皮层的交界是表皮-真皮连接。
皮肤的组织成分和形态结构均对皮肤正常的功能非常重要。真皮结构的差异性体现在不同的深度(乳头层(浅层真皮);网织层(深层真皮)),以及真皮损伤与否(正常皮肤;瘢痕组织)。
胶原纤维和弹性纤维是真皮纤维结缔组织的主要成分,并且与创面愈合、瘢痕形成以及皮肤的生物力学特性密切相关。比如,胶原纤维束的厚度和方向在真皮的浅层和深层,横切面和纵切面,以及在正常真皮和瘢痕组织中均不同。
弹性纤维直径在瘢痕组织中明显小于正常皮肤:浅层真皮中为(0.54±0.04μm vs.1.08±0.04μm);深层真皮中为(1.16±0.02μm vs.1.99±0.07μm)。真皮形态结构也会影响皮肤的生物力学性能。
但是,据我们所知,真皮结构在毛囊附近和远离毛囊区是否不同尚未见报道。组织工程皮肤是治疗大面积皮肤缺损,提高愈合后美观效果的最有希望的方法之一。
组织工程支架的物理特性,如支架组成成分、孔隙率、孔径和孔壁厚度,直接
关系到支架的制作方法,并且显著影响营养物质渗透、生物力学性能、生物降解性、细胞增殖和构成。与正常皮肤有相似的组成成分和微观结构的组织工程皮肤有望更能促进创面愈合。
因此,进一步了解皮肤微观结构会有利于制作下一代效果更好的组织工程皮肤。在第一部分研究中,我们利用连续组织切片完成了人真皮中胶原纤维和弹性纤维的三维重建,并且定量分析了毛囊和真皮深度对纤维分布的影响。
本论文中提到的胶原纤维特指I型胶原纤维。我们还利用
micro-CT(micro-computed tomography)测量了人脱细胞真皮ADM(acellular dermal matrix)孔隙率、孔径和孔壁厚度。
组织工程支架的结构显著影响组织的性能和接种细胞的活性。目前真皮支架倾向于设计成具有均一孔径的均匀结构。
然而,根据我们第一部分研究结果,在不同深度,人真皮纤维空隙和纤维结构都不是均匀的。在第二部分研究中,我们制作了一种含成纤维细胞的、具有不同孔径梯度和三层结构的仿生真皮支架。
该支架模仿了人真皮的天然结构(类似于“sandwich”结构):外层具有较大的孔径,中间层具有较小的孔径。组织学实验和westernblotting证实了,该仿生真皮支架通过促进肉芽组织生成和上皮化,进而显著促进了创面愈合。
我们的结果提示,该具有梯度孔径和“sandwich”结构的含细胞的仿生真皮支架有望用于组织工程真皮构建。在第三部分研究中,我们试图制作一种能够促进血管化的人工真皮。
因为,“sandwich”人工真皮并没有显著促进血管生成。为了解决“sandwich”人工真皮难以促进血管生成的问题,我们创新性的用一个简便的方法,制作了含
血管活性肠肽微胶囊的聚己内酯(polycaprolactone,pcl)纳米纤维膜。
血管活性肠肽(vasoactiveintestinalpeptide,vip)据报道可促进血管生成。静电纺丝技术制备的纳米纤维膜也可作为理想的创面敷料。
根据以上材料的生物学特性,我们首先把多巴胺(dopamine,da)包被在纳米纤维表面,然后利用有强吸附能力的多巴胺吸附血管活性肠肽(vip)。随后,pcl纳米纤维膜浸泡于丙酮中,包裹血管活性肠肽的微胶囊随即在原位生成。
我们用高效液相色谱法测量得到了包封率(encapsulationefficiency)是(31.8±2.2)%,载药率(loadingcapacity)是(1.71±0.16)%。多肽释放实验提示血管活性肠肽的释放时间显著延长。
激光扫描共聚焦显微镜(laserscanningconfocalmicroscope)、扫描电镜(scanningelectronmicroscope)以及细胞增殖检测
(cellcountingkit-8proliferationassays)显示细胞的粘附和增殖均显著提高。该可控性释放血管活性肠肽的pcl-da-vip纳米纤维膜有望用于创面处理和血管组织再生。
目标:该研究的其中一个目的是获得人真皮天然结构信息。另一个目的是,利用获得的天然结构信息,制作仿生人工真皮。
第一部分人真皮显微三维结构研究方法:1.通过连续切片、图像配准、图像分割,三维成形和三维可视化重建人真皮显微三维结构;2.通过“分区法”研究真皮不同分区的纤维分布差异;根据距离毛囊远近分区:靠近毛囊区(closetohairfollicles,c-hf)和远离毛囊区
(farawayfromhairfollicles,f-hf);根据真皮深度分区:从浅层真皮到深层真皮(从乳头层到网织层);3.通过micro-ct测量人脱细胞真皮(adm)的孔隙率、孔径、