内容发布更新时间 : 2024/5/21 22:57:20星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

? Inoue法制备超级感受态细胞

(主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修

复。)

越干净越好，越冷越好

将洗干净的瓶子（500ml三角烧瓶）用Milli-Q水浸泡2-3小时，倒去烧瓶中的水并将烧瓶倒扣在吸水纸上2-3分钟。用Milli-Q水配置250ml LB液体培养基。高压灭菌。

准备两盒1.5ml EP管，每盒中放置两张吸水纸，共约两百个。高压灭菌。

于早晨7-8点钟小摇菌种，挑取单菌落于5ml Milli-Q水配置且灭菌的LB液体培养基（无抗性）中，37℃培养12小时以上（OD600大于1.5）。可以用一个新的50ml 进口离心管（costa，BD等品牌都可以）来摇细菌。

晚上10点钟左右，按1：100大摇细菌。超静台内吸取2.5ml小摇细菌于高压灭菌的250ml培养基（无抗性）中， 18-22℃，200rpm摇过夜。

第二天上午测量细菌OD600值。Top10, Jm109等生长速度快的细菌约在上午9点左右OD600达到0.55左右，DH5α则要到下午4-6点钟（新手可以多摇几瓶细菌，梯度接菌，如1：50，1：100，1：200等，哪瓶到了用哪瓶，其它的可以狠心倒掉）。

将OD600达到0.55的细菌置于冰上10min（OD600在0.4-0.8之间都可以，对结果影响不大）。 4℃，4000rpm，10min集菌（用新的50ml 进口离心管）。 超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上，巨大力向下击打，尽可能去掉剩余LB。 每管倒入10ml 预冷的Inoue转化缓冲液，拧紧盖子。在冰上来回滑动重悬细菌（重悬的时间与向下击打的力度和来回滑动的速度相关，这两者于感受态效率没有直接关系）。 超静台内向每管倒入约30ml 预冷的Inoue转化缓冲液，来回颠倒混匀。 4℃，4000rpm，10min集菌。 超静台内弃上清，将管倒扣在事先灭好的吸水纸上（换一张吧，别用刚才那张），巨大力向下击打，尽可能去掉剩余缓冲液。 每管倒入10ml 预冷的Inoue转化缓冲液，拧紧盖子。在冰上来回滑动重悬细菌。 超静台内向每管加入750μl DMSO。轻轻来回混匀（记住要轻轻）。置于冰上10min。 将冰浴的感受态细胞分装到事先灭菌后并放到-20或4℃的EP管中，一个一个丢到液氮罐里，然后冻到-80（分装的体积是爱分多少分多少，建议100μl每管，传说液氮速冻可以提高5倍的感受态效率）。 按人品的好坏，感受态效率在108-107不等。

溶液配置： 0.5M PIPES 100ml PIPES 15.1g 用5M KOH调pH到6.7，然后用0.45μm的滤膜过滤除菌。 （PIPES似乎有PIPES酸和PIPES盐之分，如果你配好溶液后，测量的pH大于6.7，千万不要惊慌，可以用HCl调回到6.7，不影响结果的）

Inoue转化缓冲 液 1000ml MnCl2.4H2O 10.88g CaCl2.2H2O 2.2g KCl 18.65g PIPES，0.5M pH6.7 10ml H2O 补至1000ml 用0.45μm的滤膜过滤除菌。