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分子克隆技术实验讲义
黑龙江大学生命科学学院
2016年3月
甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定
一、实验目的
1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。 2、学习和掌握质粒、T载体的特点。
3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。 4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。
5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。 6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。
7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。 8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。 二、相关知识 (一)T载体的制备
pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物(T-A Cloning)的商业化专用载体,由pΜC 18载体改建
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而成。在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoRⅤ识别位点,用EcoRⅤ进行酶切反应后,再左两侧的3′端添加“T”而成,可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
相关知识点:(1)质粒的提取;(2)酶切;(3)PCR等。 (二)DNA的重组与连接(PCR产物的克隆)
把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中,例如从某种质粒克隆到另一种质粒,这个过程称为亚克隆。所谓重组,就是把外源目的基因“装进”载体的过程,即DNA的重新组合。为了将目的基因重组于载体分子中,需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理,一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子,使其与相同酶切过的载体分子相互连接,彼此成为配伍末端(compatible end),以产生末端连接。现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体,如专门用于克隆PCR产物的载体,大大方便了实验操作。
相关知识点:(1)克隆与亚克隆;(2)DNA重组;(3)内切酶;(4)粘性末端与平末端;(5)连接酶;(6)连接酶的分类及功能等。 (三)大肠杆菌感受态细胞的制备
外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后,需将其导入受体细胞进行扩增和筛选,得到大量、单一的重组体分子,这就是外源基因的无性繁殖,或称为克隆。受体细胞也叫宿主细胞,大肠杆菌宿主菌是目前基因工程最常用的受体细胞。感受态细胞(competent cell)是经过一定方法处理后,具有接受外源DNA能力的大肠杆菌,只有发展了感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。
相关知识点:(1)克隆;(2)宿主细胞的定义及分类;(3)感受态细胞定义及其功能;(4)转化定义及方法(DMSO、MnCl2、TB aq、PEG)等。 (四)重组DNA的转化及重组子的鉴定
将外源DNA分子导入某一宿主细胞的过程称为转化。把重组DNA分子导入到细菌中产生克隆有两个目的,一是大量产生重组DNA分子,在完成连接反应后,重组DNA分子往往只有纳克级的量,不易操作和进行下一步的分析,若把重组DNA分子导入到细菌细胞中,细菌细胞可分裂多次产生克隆,克隆中每一个细胞都含有很多个拷贝的重组DNA分子,这样重组DNA分子的量就多了;二是对重组DNA分子进行纯化,在构建重组DNA分子的过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子,连接过程完成以后体系中有多种分子存在,除了需要的重组DNA分子以外,还含有没有连接上的载体分子、没有连接上的DNA片段、自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片段的重组DNA分子,未连接上的载体和DNA片段对实验影响不大,因为它们即使导入细菌细胞,因为不能复制,很快就要被细菌细胞中的酶降解掉;对克隆工作带来影响的是后两种分子,因为它们都为环状,在细菌细胞中都能复制,因而都能产生克隆,但是每个细胞中只能导入一个质粒DNA分子,每个单克隆都是由一个细胞形成的,因此在每个克隆中所有的细胞都只含有同一种质粒。所以只要对不同的克隆进行筛选,就可以鉴定所需的重组DNA分子。
所谓的重组子(recombinant)也叫做转化子(transformant)是指吸收了重组DNA分子的转化细胞。将重组子从其它细胞群中(如上面提到的对克隆影响较大的自身环化的DNA分子和连接上污染DNA片
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段)分离出来,并鉴定无性繁殖的外源基因确实为目的基因,这过程称为筛选(screening)。根据载体体系、宿主细胞的特性以及外源基因在受体细胞表达情况的不同,初步把筛选方法分为直接筛选和间接筛选,直接筛选法又可进一步分为DNA鉴定筛选法、选择性载体筛选法、分子杂交选择法;间接筛选也可以进一步分为免疫学方法、mRNA翻译检测法;本试验采用平板筛选法中的蓝白筛选法。
相关知识点:
①转化(transformation) 质粒(plasmid) ②转染 (transinjection) 噬菌体(phage) ③显影注射
(1)导入的方法 ④电转化 2.5kv
⑤基因枪 geneblaster ⑥脂质体介导法
⑦其它方法:快速冷冻法、碳化硅纤维介导法
(2)重组子: 转化子
(3)重组反应体系中的成分:①②③④⑤⑥ (4)筛选的方法
①直接筛选法
②间接筛选法
免疫学方法
酶免疫检测
mRNA翻译检测法
DNA鉴定筛选法:定位、测序
选择性载体筛选法:λph包裹、抗药性 α-互补 分子杂交筛选法:ISH、Southern Blot
免疫化学
(五)质粒DNA的提取(碱裂解法)
原核生物没有真正的细胞核,DNA一般位于一个类似“核”的结构——称为类核体上(因为不是一个完整的细胞核)。E.coli的遗传物质主要是染色体DNA ,E.coli的染色体为双股环状DNA,含有1 400个以上的基因,另外还有一些质粒DNA。
1、质粒的概念
质粒是细菌(如E.coli)染色体外的小型环状双链DNA分子。一般说来,质粒不是细菌生长繁殖所必须的结构,就细胞生存而言,质粒是可有可无的。质粒分子本身含有复制功能的遗传结构,故能在细菌内独立地进行复制,并在细胞分裂时恒定地遗传给子代细胞。
2、研究质粒的意义
(1)质粒作为一种裸露的,比病毒更简单、更有自主复制能力的DNA分子,正好处于生命与非生命的分水岭上。由于质粒能够复制、能够传递、能够表达其遗传信息,说明质粒是独立的有机体,是亚细胞生命体系的成员,是比病毒更简单的原始生命形态,所以质粒是研究生命起源的一块重要的基石。
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