内容发布更新时间 : 2024/11/14 12:23:15星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

授课纲要

实验二：遗传病基因突变分析

1） 实验目的：

通过实验熟悉DNA的提取、聚合酶链反应（PCR）以及DNA单链构象多态性分

析（SSCP）等几种分子生物学实验方法，并了解SSCP分析法是检测基因突变的一种基本方法。 2）实验原理:

① DNA抽提

核基因DNA可以从任何有核细胞中提出，人外周静脉血的淋巴细胞是抽提人核基因DNA最方便的材料。在抽出的外周静脉血中加入枸橼酸钠抗凝，经离心处理后可分离得到大量淋巴细胞的细胞核。由于DNA在细胞核内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取过程中必须将其中的蛋白质除去，蛋白酶K可用于消化细胞核膜及核内蛋白质，消化的蛋白质用饱和NaCl沉淀，核DNA最后用酒精析出。

② 聚合酶链反应 聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种体外由引物介导的特定DNA序列的酶扩增方法，由于此方法对样本要求的微量性以及它特异、敏感、高速的特性，近年来得到广泛应用。全过程是基于一套“三步曲”的若干轮次的循环组合而成的。依次为DNA模板热变性，双链DNA解链成单链；在低温下与引物退火，引物与单链DNA互补配对；在适宜温度下Taq DNA聚合酶催化引物延伸。

③ 单链构象多态性分析

单链构象多态性(Polymerase Chain Reaction-Single Strand ConformationPolymorphism, SSCP) 分析法是一种DNA单链凝胶电泳技术,该法具有快速、简便、灵敏和适用于大样本筛查的特点，可有效检出碱基置换、缺失、插入等基因变异。SSCP原理是在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中，单链DNA迁移率除与DNA长度有关外，更主要取决于DNA单链所形成的空间构象，相同长度的单链DNA因其顺序不同或单个碱基差异，所形成的构象就会不同。PCR产物经变性后进行单链DNA凝胶电泳时，每条单链处于一定的位置，靶DNA中若发生碱基缺失、插入或单个碱基置换时, 就会出现泳动变位，从而提示该片段有基因变异存在。对于小于300bp单链DNA片段，SSCP分析的检测灵敏度可达90%-99%。随着DNA长度增加，其检测灵敏度相对减弱。

3）实验准备：

实验材料：人外周静脉血 实验器材：PCR仪等 主要试剂：（参考教材） 4）实验步骤：

(1) DNA抽提（已经制备好） (2) PCR操作（上节课已完成）

(3) SSCP实验步骤

① 8%的聚丙烯酰胺凝胶配置 ② DNA样品的处理与加样：

7.5?l PCR产物与15 ?l loading buffer混合后，100?C沸水中加热变性8分钟，

冰水浴中骤冷10分钟，然后马上加样。

③ 在电泳槽中，以1×TBE作为电泳缓冲液，140伏电泳约2小时。由PCR产

物的长度来决定电泳时间的长短。 ④ 银染：

用银染的方法来检测DNA分子是一种灵敏而简单的手段。利用银离子可与核酸结合的特性，在甲醛作用下银离子还原为Ag，使凝胶中DNA条带显黑色。银染法具有需要样本量少，操作简便，且无同位素污染，结果可以永久保存的特点，是十分方便、敏感的方法。 5）结果分析：

正常人样品目的区带有3条：一条双链扩增产物带 ，两条单链带。单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，所以一般形成两条单链带。两条单链带一般在双链带后边。对显性遗传病来说，如有基因突变，则除了原正常单链带，另出现突变带。一般认为，如没有污染，SSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果。后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相差无几所致。对阴性结果，适当改变电泳条件，可提高突变检出率。 6）注意事项

① SSCP分析的灵敏性与核酸片段大小有关，片段越小，检测的敏感性越高。对于小于300bp的片段，SSCP可发现90%的变异；而大于350bp的片段，则难以发现其中变异。

② 凝胶厚度和浓度

SSCP分析一般采用5%-10%的凝胶。浓度不同，突变带的相对位置也有差异。

③ SSCP需要有大量的正常对照一起分析，不能仅仅只是患者的样本。另外，还必须排除人群中的多态性。

实验三：人类染色体Ｇ带标本制备及观察

1） 实验目的

通过实验掌握Ｇ带标本制备的基本方法，学会在显微镜下直接观察G带分裂相。 2） 实验原理

将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行预处理，然后用Giemsa染色。胰酶可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分（多为疏水蛋白）。A-T相对丰富的区域与蛋白质结合紧密，较耐受胰酶处理，染为深带， G-C相对丰富的区域与蛋白质结合疏松，经胰酶处理后，蛋白质遭破坏，染为浅带。总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。 3） 实验准备：

实验材料：（第一次课的染色体标本） 实验器材：

药品和试剂：胰酶液（100ml HanKs液中，搅拌半小时，用1ＮNaOH调pH7.0-7.2，

冷冻保存）， Giemsa染液，生理盐水

4） 实验步骤：

A、先将胰酶液水浴加热到37℃。

B、将染色体标本浸入胰酶液中，作用时间几秒到几十秒不等，

C、取出玻片标本，在生理盐水中过一下，再经过蒸馏水洗。

D、Giemsa 染色8分钟。 E、自来水洗、晾干。 F、镜检。

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5) 注意事项：

① 带效果的好坏，主要决定于染色体的标本质量。标本染色体要长，染色体分散合适，背景无胞浆，标本未老化即保存时间过长。

② 要注意胰酶处理的温度和时间。稳定显带的条件，才能保证显带效果。 6) 作业：

完成人类染色体标本制备及G带制备与观察的系统实验报告

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