内容发布更新时间 : 2024/5/21 16:01:14星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

Western blotting试验方法

1. 试剂配制

1.1 配胶溶液

（1） 1.0mol/L Tris·HCl（PH 6.8） Tris (MW121.14) 12.11g

双蒸水 80ml（定容至100ml）

溶解后，用浓盐酸（5-10ml）调pH至6.8，最后用双蒸水定容至100ml，高温灭 菌后室温下保存。 （2）1.5mol/L Tris·HCl（pH 8.8） Tris (MW121.14) 45.43g

双蒸水 200ml（定容至250ml）

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用双蒸水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 （3）10％ SDS（PH 7.2） SDS 10g

双蒸水至 100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 （4）10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g

双蒸水 1.0ml

4℃保存，保存时间为1周。 （5）30％Acr/Bic（14.55：1）（PH<7.0） 丙稀酰胺（Acr） 29g 甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g 双蒸水至 100ml 溶解后（37℃助溶），用NaIgene滤器(0.45μm孔径)过滤，检测溶液的pH值不大于7.0，4℃置棕色瓶中保存，使用时恢复至室温且无沉淀。 （6）TEMED 分装使用，避光保存，剧毒，挥发。

1.2 其它溶液

（1）裂解液 购买 （2）Marker 购买 （3）4×SDS上样缓冲溶液 可购买 1.0mol/L Tris·HCl（PH 6.8） 10ml SDS 4g 甘油 20ml DTT 3.12g 溴酚蓝 0.04g 双蒸水至 50ml （4）5×蛋白电泳液缓冲液（用时稀释成1×）

Tris（MW121.14） 7.55g

甘氨酸（MW75.07） 188g

SDS 2.5g

双蒸水 100ml（定容至500ml）

先加100ml双蒸水，磁力搅拌至完全溶解，定容至500ml，室温保存。外槽电泳液可反复使用3次。 （5）10×蛋白电泳转移缓冲液（湿转）（用时稀释成1×）

Tris（MW121.14） 7.5g 甘氨酸（MW75.07） 37.54g

双蒸水 200ml（定容至250ml）

磁力搅拌至完全溶解，加双蒸水至250ml；临用前加甲醇至终浓度20%（50mlA+350ml水+100ml甲醇），室温保存，此溶液可重复使用3～5次。 （6）G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）

考马斯亮蓝G250： 100mg 95％乙醇： 50ml

85%正磷酸： 100ml 双蒸水至 1000ml

配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。分装使用，-20°C保存。 （7）10×丽春红染液（用时稀释成1×）

丽春红S 2g 三氯乙酸 30g 磺基水杨酸 30g 双蒸水至 100ml 可反复使用3-5次。 （8）20％Tween20 Tween20 20ml 双蒸水至 100ml 混匀后4℃保存。 （9）10×TBS缓冲液（用时稀释成1×）

Tris 12.1g NaCl 40g 双蒸水至 500ml

高压灭菌，室温保存。待配置TBST缓冲液使用。 （10）TBST缓冲液（含0.05％Tween20的TBS缓冲液）

20％Tween20 500μl 10×TBS 50ml 双蒸水 450ml 混匀后即可使用，最好现配现用。 （11）0.01mol/L PBS缓冲液（PH 7.2） KCl 0.2g KH2PO4 0.2g NaCl 8g Na2HPO4 2.08g 双蒸水 1000ml

溶于800ml双蒸水中，用浓盐酸调整PH至7.2，再定容至1L，高温灭菌后，4℃保存。 （12）封闭液（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液）

脱脂奶粉（国产，安怡牌） 5g TBST 100ml

（13）5%BSA（牛血清白蛋白） BSA 0.5g TBST 10ml （14）一抗 购买 （15）二抗 购买 （16）显影液（5×） 自来水（加热至50℃） 375ml （以下药品加到温水中） 米吐尔 1.55g

亚硫酸钠（无水） 22.5g 碳酸钠（无水） 33.75g 溴化钾 20.95g 双蒸水至 500ml

配制时，上述药品应逐一加入，待一种试剂溶解后，再加入后一种试剂。4℃保存。使用时用双蒸水稀释至1×。 （17）定影液 自来水（50～60℃） 700ml （以下药品加到温水中） 硫代硫酸钠 240g 亚硫酸钠（无水） 15g 冰乙酸 12.6ml 硼酸 7.5g

钾明矾 15g（水温冷至30℃以下时再加入） 加双蒸水定容至1000ml，室温保存

2. 蛋白样本提取制备

2.1 细胞组织裂解

2.1.1细胞裂解

裂解液Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择

细胞裂解操作方法：