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离子交换柱层析分离核苷酸

来源：互联网 作者：未知 发布时间：2006-08-06

一、实验目的

本实验以酵母RNA为材料，将RNA用碱水解成单核苷酸，再用离子交换柱层析进行分离，最后采用紫外吸收法进行鉴定。同时通过测定各单核苷酸的含量，可以计算出酵母RNA的碱基组成。 本实验的目的是：

1. 了解掌握RNA碱水解的原理和方法 2. 掌握离子交换柱层析的分离原理和方法 3. 熟练掌握紫外吸收分析方法 二、实验原理

1. RNA的碱水解

实验室制备单核苷酸一般用化学水解法（酸、碱水解）和酶解法。RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤碱基；用碱水解可得到2’一核苷酸和3’一核苷酸的混合物；用5’一磷酸二酯酶或3’一磷酸二酯酶水解则分别可得到5’一核苷酸或3’一核苷酸。

RNA用碱水解，经过2’、3’一环核苷酸中间物，而后水解生成2’一核苷酸和3’一核苷酸。如下图所示。

碱水解一般采用0.3M的KOH，37℃保温18~20小时就能水解完全（也可以用1M KOH，80℃水解60min或0.1M KOH 100℃水解20min）。水解毕，用2M HClO4中和并逐滴调节至pH=2左右，生成的KClO4沉淀，离心去除之。上清液即为各单核苷酸的混合液。然后根据所选离子交换剂的类型，将上清液调至适当的pH值，作样品液备用。一般用阳离子交换剂，pH调至1.5左右，用阴离子交换剂，pH调至8 ~ 9(逐滴)。此处用KOH是为了便于除去钾离子以降低样品溶液中的离子强度。

2. 单核苷酸的离子交换柱层析分离

离子交换层析是根据各种物质带电状态（或极性）的差别来进行分离的。电荷不同的物质对离子交换剂有不同的亲和力，因此，要成功地分离某种混合物，必须根据其所含物质的解离性质，带电状态选择适当类型的离子交换剂，并控制吸附和洗脱条件（主要是洗脱液的离子强度和pH值）,使混合物中各组分按亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。

在离子交换层析中，分配系数或平衡常数（Kd）是一个重要的参数： Kd = Cs / Cm

式中：Cs是某物质在固定相（交换剂）上的摩尔浓度，Cm是该物质在流动相中的摩尔浓度。可以看出，与交换剂的亲和力越大，Cs越大，Kd值也越大。各种物质Kd值差异的大小决定了分离的效果。差异越大，分离效果越好。影响Kd值的因素很多，如被分离物带电荷多少，空间结构因素，离子交换剂的非极性亲和力大小，温度高低等。实验中必须反复摸索条件，才能得到最佳分离效果。 核苷酸分子中各基团的解离常数（pK）和等电点 p I 值见表1。

表 1 四种核苷酸的解离常数（pK）和等电点pI值

核苷酸 第一磷酸基 pKa1 第二磷酸基 pKa2 含氮环的亚氨基（－NH+ =） pKa3 等电点 pI值* 尿苷酸UMP鸟苷酸GMP腺苷酸AMP胞苷酸

CMP 1.0 0.7 0.9 0.8 6.4 6.1 6.2 6.3 2.4 3.7 4.5 1.55 2.35 2.65 *注：pI = (pKa1 + pKa3) / 2

由表1可见,含氮环亚氨基的解离常数（ pK ）值相差较大，它在离子交换分离四种核苷酸中将起决定作用。

用离子交换树脂分离核苷酸，可通过调节样品溶液的pH值使它们的可解离基团解离，带上正电荷或负电荷。同时减少样品溶液中除核苷酸外的其它离子的强度。这样，当样品液加入到层析柱时，核苷酸就可以与离子交换树脂相结合。洗脱时，通过改变pH值或增加洗脱液中竞争性离子的强度，使被吸附的核苷酸的相应电荷降低，与树脂的亲和力降低，结果使核苷酸得到分离。

混合核苷酸可以用阳离子或阴离子交换树脂进行分离。采用阳离子交换时，控制样品液pH值在1.5，此时UMP带负电，而AMP、CMP、GMP带正电，可被阳离子树脂吸附。然后通过逐渐升高pH值，将各核甘酸洗脱下来，次序是UMP-GMP-CMP-AMP。AMP与CMP洗脱位置的互换，是由于聚苯乙烯树脂母体对嘌呤碱基的非极性吸附力大于对嘧啶碱基的吸附力造成的。

本实验采用聚苯乙烯一二乙烯苯三甲胺季铵碱型粉末阴离子树脂（201×8）分离四种核苷酸.首先使RNA碱水解液中的其它离子强度降至0.02以下，然后调pH值至6以上，使样品核苷酸都带上负电荷，它们都能与阴离子交换树脂结合。结合能力的强弱，与核苷酸的pI 值有关，pI 越大，与阴离子交换树脂的结合力越 弱，洗脱时越易交换下来。由表1可见，当用含竞争性离子的洗脱液进行洗脱时，洗脱下来的次序应该是CMP、AMP、GMP和UMP。由于本实验所用的树脂的不溶性基质是非极性的,它与嘌呤碱基的非极性亲和力大于与嘧啶碱基的非极性亲和力。所以，实际洗脱下来的次序为：CMP、AMP、UMP和GMP。对于同一种核甘酸的不同异构体而言，它们之间的差别仅在于磷酸基位于核糖的不同位置上，2’—磷酸基较3’—磷酸基距离碱基更近，因而它的负电性对碱基正电荷的电中和影响较大,其pK 值也较大。例如2’-胞苷酸的pK1=4.4 ，3’-胞苷酸的pK1 = 4.3 ，因此2’一核苷酸更易被洗脱下来。

应注意的是，样品不易过浓，洗脱的流速不宜过快，洗脱液的pH值要严格控制。否则将使吸附不完全，洗脱峰平坦而使各核苷酸分离不清。 3. 核苷酸的鉴定

由于核苷酸中都含有嘌呤与嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键（—C=C—C=C—），它能够强烈地吸收250~280毫微米波段的紫外光，而且有特征的紫外吸收比值。因此，通过测定各洗脱峰溶液在220~300毫微米波长范围内的紫外吸收值，作出紫外吸收光谱图，与下图所示的标准吸收光谱进行比较，并根据其吸光度比值（250nm/260nm, 280nm/260nm, 290nm/260nm）以及最大吸收峰与下页“表2”所列标准值比较后，即可判断各组分为何种核苷酸。

根据各组分在其最大吸收波长（lmax）处总的吸光度（总Amax ）以及相应的摩尔消光系数（E260 nm）, 可以计算出RNA中四种核苷酸的微摩尔数和碱基摩尔数百分组成。

四种核苷酸在pH = 2 ~ 4时的紫外吸收光谱曲线

（1）

（2）

溶液的pH值对核苷酸的紫外吸收光度值影响较大，故测定时需要调至一定的pH值。 三、试剂与器材 试剂： 1. 酵母RNA

2. 强碱型阴离子交换树脂201×8。聚苯乙烯 一 二乙烯苯 一 三甲胺季铵碱型，全交换量大于3毫摩尔/克干树脂，粉末型100~200目。

3. 1M甲酸：21.4ml 88%甲酸定容至500ml。

4. 1M甲酸钠：34.15g纯甲酸钠（注意结晶水问题）用蒸