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微生物鉴定之生化实验大全

入社群：听大咖微课+看医学视频+会议直播微生物鉴定之生化实验大全

不同的细菌具有各自的独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又具有不同的生物化学特性，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。掌握各种生化反应的原理和应用是细菌鉴定的基础。生理生化特性的测定主要根据Shirling＆Gottlieb《International Journal of Systematic Bacteriology》中鉴定的有关试验。

（一）碳水化合物代谢实验： 糖（醇、苷）类发酵实验

（1）原理：细菌分解糖的能力与该菌是否含有分解某种糖的酶密切相关，故分解糖的能力各不相同，细菌分解糖类后的终产物亦不一致，在含糖培养基中加入指示剂，若细菌分解糖则产酸或产酸产气，使培养基颜色改变，从而判断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物。

（2）基本培养基：在培养基中加入0.5%-1%的糖类（单糖、双糖、或者多糖）、醇类（甘露醇、肌醇）苷类（水杨苷、菊糖等）。培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。

（3）实验方法：取某一种细菌的24h纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等培养基内，37℃培养24h，观察结果并记录。 （4）结果判定

如果接种进去的细菌可发酵某种糖或醇，则可产酸，使培养基由紫色变成黄色，如果不发酵，则仍保持紫色。如发酵的同时又产生气体，则在微量发酵管顶部积有气泡。 （5）应用：是鉴定细菌最主要最基本的实验，特别是对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。 氧化型与发酵型(O/F)的测定

（1）原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必需有氧的参加的，称为氧化型，细菌在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解的，称为发酵型。发酵型细菌无论在有氧或者无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。 （2）培养基：培养基蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，葡萄糖10g，琼脂3g，1％溴麝香草酚蓝3mL，蒸馏水1000mL。将蛋白胨、盐、琼脂和水混合，加热溶解，校正pH至7.2，然后加葡萄糖和指示剂，加热溶解；分装试管，3～4mL/管；115℃，高压蒸汽灭菌20min，取出后冷却成琼脂柱。

（3）实验方法：挑取18～24h的幼龄斜面培养物，穿刺接

种，每种细菌接种两管，于其中1管覆盖1mL灭菌的液体石蜡，37℃培养24小时或更长时间。 （4）结果判定。β一半乳糖苷(ONPG)实验

（1）原理：有的细菌可以产生β一半乳糖苷酶，能分解邻－硝基酚－β－D－半乳糖苷，而生成黄色的邻－硝基酚，在很低浓度下也可以检测出。

（2）培养基：邻硝基酚β-半乳糖苷0.6g，0．01mol／L pH7．5磷酸缓冲液1 000mL，pH 7．5的灭菌1％蛋白胨水300mL。先将前两种成分混合溶解，过滤除菌，在无菌条件下与1％蛋白胨水混合，分装试管，每管2～3mL，无菌检验后备用。 （3）实验方法：取一环细菌纯培养物接种在ONPG培养基上置37℃培养1～3h或24h，如有β－半乳糖苷酶，会在3h内产生黄色的邻硝基酚；如无此酶，则在24h内不变色。 七叶苷水解实验

（1）原理：有的细菌可以将七叶苷分解为七叶素和葡萄糖，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。

（2）应用：主要用于肠球菌与其它链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性，也可用于革兰氏阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。 甲基红实验

（1）原理：细菌分解培养基中的葡萄糖产酸，当产酸量大，使培养基的pH降至4．5以下时，加入甲基红指示剂而变红，