内容发布更新时间 : 2024/5/20 17:05:51星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

实验目的：

提取动物组织RNA，备后续实验使用。

实验试剂：

研钵、镊子、刮勺、冰盒、试管架、微量移液器、RNA无酶管、低温离心机、酒精、液氮、Takara RNA提取试剂盒、去除DNA试剂盒冰袋

实验步骤：

1、实验准备：研钵中加入少量酒精，点燃，灭菌后，超净台灭菌30min（包括研钵、镊子、刮勺、试管架、微量移液器、RNA无酶管）。

2、取液氮、冰袋备、冰盒备用

3、将研钵预冷，其中大研钵的可以放在冰袋上，然后再倒入液氮，小研钵直接倒入少量液氮预冷。

4、将超低温冻结的 RNA 提取样品，剪取绿豆到黄豆大小组织（不能太大，不要大于黄豆大小），迅速转移至用液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状（无明显的可见颗粒，如果没有研磨彻底会影响 RNA 的收率和质量）。可用刮勺将其刮到一团。

5、可以向4的研钵中加入适量的含有裂解液的Buffer RL，（大约700ul），确保研磨成粉末状的样品完全覆盖，然后室温静置（研钵倾斜放置），直至样品完全融化后用

枪头吹打混匀，只至液体中无明显沉淀。这期间可以研磨下一组织。

6、将步骤5中的匀浆液转移至1.5mlRNA无酶管中，12,000 rpm， 4℃离心 5 分钟。期间配置70%乙醇（7份无水乙醇+3份水（为试剂盒中的RNA无酶水））

7、小心吸取6步骤上清液（吸取400ul即可），移入1.5ml的RNase Free collection（切

勿吸取沉淀，否则会阻塞后面的膜）。然后向其中加入等体积的70%乙醇，此时可见沉淀，

立即摇匀。

8、将7中的混合液，取600ul（要小于600ul）到 RNA spin column （含2ml collection Tube）中，12,000 rpm， 4℃离心 1 分钟，弃滤液。将RNA spin column 放到2ml collection Tube管中。

9、将500ul buffer RWA加入至RNA spin column 12,000 rpm，4℃离心30s，弃滤液。 10、将600ul buffer RWB 沿壁加入至RNA spin column 12,000 rpm， 4℃离心30s，弃滤液。

11、消化DNA

配置DNase I 反应液： 5ul 10xDNase I Buffer， 4ul Recombinant DNase 41ul Rnase free H2O ，混合均匀。

向RNA spin column膜中央加入50ul DNase I 反应液，室温静止15min（不弃液体） 向RNA spin column 膜中央沿壁加入350ul buffer RWB，12,000 rpm， 4℃离心30s，弃滤液。

12、将600ul buffer RWB 沿壁加入至RNA spin column 12,000 rpm， 4℃离心30s，弃滤液。

13、将RNA spin column安置于2ml collection Tube管中，空管离心2min

14、将RNA spin column安置于 1.5ml的RNase Free collection （试剂盒提供），在RNA spin column 膜中央加入100ul RNA无酶水，室温静止5min，12000 4℃离心2min，洗脱RNA。

15、12000 4℃离心2min，洗脱RNA。

16、将15中的滤液体，重新吸出，加到RNA spin column 膜中央，室温静止5min，12000 4℃离心2min，洗脱RNA。

17、上述16中的滤液即RNA液。