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实验六 植物总RNA提取与琼脂糖凝胶电泳分析（也可以用第三版上的内容） 【实验目的】

熟悉植物总RNA提取及提取RNA质量的琼脂糖凝胶电泳分析方法。 【实验原理】

用含有异硫氰酸胍变性剂的提取液抽提植物组织粉末，一方面可以和β-巯基乙醇联合作用高效抑制RNase的活性，防止RNA的降解，另一方面又可使蛋白质变性并使其溶解，在酸性条件，提取液进一步经过酚/氯仿抽提去除蛋白质、DNA、多糖等杂质，RNA可被异丙醇沉淀。

【器材与试剂】

1．实验仪器 高速冷冻离心机，陶瓷研钵，液氮罐，微量移液器，电泳仪，电泳槽，紫外分析仪，水浴锅，烘箱

2．实验试剂 提取液：4 mol/L异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠（pH 7.0），0.5％ 十二烷基肌氨酸钠，0.1 mol/L β-巯基乙醇；醋酸钠溶液（2 mol/L ,pH 4.0），水饱和苯酚（pH 3.5），氯仿/异戊醇（24：1，v/v），乙醇，异丙醇，焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，简称DEPC），琼脂糖，甲醛，10×电泳缓冲溶液：200 mmol/L吗啉代丙磺酸（pH7.0），20 mmol/L醋酸钠，10 mmol/L EDTA（pH8.0），过滤除菌后避光保存；5×载样缓冲溶液：16 μL水饱和溴酚蓝，80 μL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），720 μL 37%甲醛，2 mL甘油，3.084 mL甲酰胺，4 mL 10×电泳缓冲溶液，加DEPC处理过的水至10 mL,4℃保存；0.5 μg/mL溴化乙锭染色液（1×电泳缓冲溶液配制） 3. 实验材料 新鲜的烟草叶片 【实验步骤】 一、RNA的提取

1. 取两只10 mL离心管，各加入3 mL冰冷的提取液，置于冰上。

2. 取0.5 g新鲜的烟草叶片组织放在液氮预冷的研钵中，倒入液氮，迅速研磨成粉末。 3. 将粉末移入盛有提取液的离心管中，振荡，使植物材料和溶液充分混合，后将离心管置于冰上。

4. 向离心管中依次加入0.3 mL醋酸钠溶液、3 mL水饱和酚和1 mL氯仿/异戊醇，快速颠倒离心管数十次，冰上放置15 min。

5. 4℃，12 000×g离心30 min, 将上层水相转移到另一个离心管中，加入等体积的异丙醇，

混匀，-20℃静置30 min。

6. 4℃,12 000 ×g离心20min，弃上清，倒置离心管使溶液尽可能流干，沉淀重新溶于0.7 mL提取液，4℃,12 000 ×g离心10min，上清移入一1.5 mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，混匀后，-20℃静置30 min。

7. 4℃，12 000×g离心30min，弃上清，沉淀用70％乙醇润洗一次，用微量移液器吸走乙醇溶液，室温放置使残留乙醇挥发干净，加入50 μL DEPC处理的水溶解，得RNA溶液。 二、变性琼脂糖凝胶电泳

1．称取1.5 g 琼脂糖，加入DEPC处理的水72 mL，加热溶化后，冷却到50～60℃，再依次加入10×电泳缓冲溶液10 mL和甲醛18 mL，混匀后制胶。

2．取16 μL RNA溶液放入一Eppendorf管中，加入4 μL 5×载样缓冲溶液，65℃保温5 min，迅速置于冰上，上样前短暂离心。

3．点样后，80V恒压电泳，溴酚蓝迁移超过凝胶的1/2处时停止电泳。 4． 凝胶用溴化乙锭染色液染色30 min，紫外等下观察。 【注意事项】

1．为尽可能的避免RNA的降解，实验所用玻璃器皿洗净后必须于烘箱内于180℃烘烤8 h以上，所用的溶液及塑料器皿必须用DEPC处理，操作环境尽量干净。

2. 为了减少RNase污染并避免DEPC、溴化乙锭、甲醛等对人体的毒害，实验过程中应戴手套操作，并经常更换。 【实验作业】

1． 如何判断所提取的RNA是否完整？

2． 电泳上样前，为什么要对RNA样品进行处理？

参考文献

1． 王关林，方宏筠.植物基因工程原理与技术.北京：科学出版社，1998，608 2． 刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2002. 57~66

3． J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著. 分子克隆实验指南（第三版）.黄培堂等译. 北京：科学

出版社，2002，540

实验七 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达

【实验目的】

熟悉异丙基-β-D 硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，简称IPTG）诱导外源基因在大肠杆菌中表达的原理和方法。 【实验原理】

在E.coliBL21(DE3)染色体DNA中插入了T7 RNA聚合酶基因，该基因的上游为Lac启动子，在正常条件下，大肠杆菌Lac操纵子中LacI编码的阻遏蛋白结合在该Lac启动子以及pET-15b 质粒T7启动子的附近LacO上，抑制T7 RNA聚合酶基因的表达，从而抑制了pET-15b 上T7启动子下游外源基因的表达。当培养基中存在 IPTG时，IPTG与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白成为非活性形式，解除了阻遏蛋白对Lac启动子和T7启动子的抑制，T7 RNA聚合酶基因表达，它与T7启动子结合诱导其下游外源基因的转录，转录产生的mRNA经过翻译表达出目的蛋白。

本实验选用的工程菌为转化了pET-15bcrtE的E.coliBL21(DE3)。pET-15crtE是通过将噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）编码牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶的crtE，在Nde I和Xho I位点克隆到pET-15b中而构建的，crtE的起始密码子（ATG）与pET-15b上的多聚组氨酸标签（His-tag）的编码序列融合。crtE基因全长906 bp，编码蛋白（包括His-tag）的分子量约为35 kDa。 【器材与试剂】

1．实验仪器 细菌培养箱，摇床，台式离心机，微量移液器，电泳仪，电泳槽，电炉 2．实验试剂 蛋白胨，酵母提取物，NaCl，1 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 30%凝胶贮液：29%丙烯酰胺，1% N,N-亚甲双丙烯酰胺；10%十二烷基硫酸钠（SDS），N,N, N’,N’-四甲基乙烯二胺（TEMED），10%过硫酸铵，标准分子量蛋白，蛋白电泳缓冲溶液：25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸，0.1% SDS,pH8.3；1.5 mol/L Tris-Cl(pH8.0)，1 mol/L Tris-Cl(pH6.8),蛋白栽样缓冲液（2×）：50 mmol/L Tris-Cl(pH6.8)，100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），2% SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝；染色液：0.2%考马斯亮蓝 R250，40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸；脱色液：40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸

3．实验材料 pET-15b，pET-15bcrtE，E.coliBL21(DE3) 【实验步骤】

1．将pET-15b，pET-15bcrtE分别转化E.coliBL21(DE3)，涂布在含100 μg/mL 氨苄青霉素

钠的LB培养基平板上，37℃，培养至菌落清楚。

2．分别挑取转化pET-15b（对照）和pET-15bcrtE的大肠杆菌单菌落，接种于20 mL含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37℃，振荡培养（250 r/min）过夜。

3. 取2 mL过夜培养物分别接种到20 mL含100 μg/mL氨苄青霉素钠的LB液体培养基中,相同条件下继续培养3 h。

4．分别加入20 μL IPTG溶液，相同条件下，继续培养3 h。

5．分别取300 μL培养物于一Eppendorf管中，10 000 rpm离心1 min，取沉淀。 6．沉淀用20 μL蒸馏水悬浮，加入20 μL 蛋白载样缓冲液，混匀，100℃煮沸5 min。 7．冷却后，剧烈震荡 剪断DNA，10 000 rpm离心10 min。

8．分别取对照和工程菌样品20 μL用于SDS-PAGE分析，分离胶的浓度为12%。 9．凝胶用染色液染色1～2 h，用脱色液脱色至条带清晰。

10．比较只转化pET-15b的对照菌和工程菌蛋白条带的差异，找出外源基因编码的目的蛋白。 【注意事项】

1．为了获得较高的目的蛋白表达水平，加入IPTG诱导时的工程菌培养物的OD600最好不要超过1。

2．为了获得比较好的电泳效果，在进行SDS-PAGE分析前应剧烈振荡样品，剪断DNA以降低样品黏度，并离心去除不溶性的细胞裂解物。 【实验作业】

1． 影响外源基因在工程菌中表达量的因素有哪些？ 2． 如何提高工程菌中可溶性目的蛋白的水平？

参考文献

1. Primrose SB，Twyman RM，Old RW. Principles of gene manipulation (6th ed.). Blackwell Publishing，2001，74～75

2. 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 381～384

3. 汪靖超，孙东平，杜桂彩等. 噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达. 食品科学，2007，28（7）：276～279

4. Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., et al. Elucidation of the Envinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli. J Bacreriol，1990, 172: 6704～6712

* pET-15bcrtE可向青岛大学生物系索要，联系方式：lrg@qdu.edu.cn

实验八 亲和层析纯化重组蛋白

【实验目的】

学习利用镍离子螯合树脂亲和纯化带有多聚组氨酸标签（His-tag）的重组蛋白。 【实验原理】

利用镍离子螯合树脂特异结合多聚组氨酸的特性，若外源基因编码的目的蛋白在其N-末端或C-末端融合了His-tag，则具有His-tag的重组蛋白可特异结合在镍离子树脂上而将其纯化，经过低浓度咪唑溶液洗涤后，可用高浓度的咪唑溶液将重组蛋白从树脂上洗脱下来，纯化蛋白的纯度可用SDS-PAGE法进行检测。 【器材与试剂】

1．实验仪器 摇床，高速冷冻离心机，超声波细胞破碎仪，微量移液器，电泳仪，蛋白电泳槽

2．实验试剂 蛋白胨，酵母提取物，NaCl，1 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 0.1 mol/L NiCl2，镍离子螯合树脂（His.Bind Resin，美国Novagen公司），结合缓冲溶液：0.5 mol/L NaCl,5 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-Cl，pH8.0；洗涤缓冲液：0.5 mol/L NaCl,60 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-Cl，pH8.0；洗脱缓冲液：0.5 mol/L NaCl,0.5 mol/L咪唑，20 mmol/L Tris-Cl，pH8.0；30%凝胶贮液：29% 丙烯酰胺，1% N,N-亚甲双丙烯酰胺；10% 十二烷基硫酸钠（SDS），N,N, N’,N’-四甲基乙烯二胺（TEMED），10%过硫酸铵，标准分子量蛋白，蛋白电泳缓冲溶液：25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸，0.1% SDS,pH8.3；1.5 mol/L Tris-Cl(pH8.0)，1 mol/L Tris-Cl(pH6.8)，蛋白栽样缓冲液（2×）：50 mmol/L Tris-Cl(pH6.8)，100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），2% SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝；染色液：0.2%考马斯亮蓝 R250,40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸；脱色液：40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸

3．实验材料 转化了pET-15bcrtE的E.coliBL21(DE3)（工程菌） 【实验步骤】

1．取2 mL左右的树脂装入一小层析柱内，待凝胶沉淀且保护剂流净后，用10 mL蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 mL 0.1 mol/L NiCl2溶液，待其流干净后，用10 mL结合缓冲溶液平衡层析柱。

2．接种工程菌于20 mL含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37℃，振荡培养（250 r/min）过夜。

3．将过夜培养物转接到500 mL含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37℃，振