内容发布更新时间 : 2024/5/6 3:50:58星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)是迄今较为肯定的肿瘤标志物,忆广泛用于临床肿瘤诊断，两者的检测已有RIA、EIA和IRMA等方法。近来发展的时间分辨荧光和化学发光测量技术，信噪比较高，分析灵敏度超过了上述方法［2］［1］。我们在完成了AFP、CEA和IRMA工作的基础上，采用时间分辨荧光测量技术，建交了时间分辨免疫荧光分析（Time-resolved Immunofluormetric assay,IFMA），并与化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay,CLIA）进行比较。 1材料与方法 试剂与设备 抗CEA单抗C17和C50，抗AFP单抗137和47由无锡市第二制药厂提供。Eu标记盒（1244-302），Eu发光增强液（B118-110）、AFP和CEA参考标准，EG＆G-Wellac产品。二乙烯三胺五乙酸酐（DTPA），Sigma产品。PD-10和Sepharose CL-6B,Pharmecia产品。CA-19-9、CA-12-5和CA-15-3参考标准，AFP和CEA CLIA药盒，CIBA-CORNING产品。牛IgG自制。去离子超纯水由本室采用Barnsteed公司超纯水器（D7033）制备。96孔微扎板，Nunc产品。BSA，上海生物制品的产品。其他试剂均为国产分析纯。全自动IFMA检测仪（Auto DELFIA1235）为EG＆G-Wellac产品。全自动ＣＬＩＡ检测仪（ＡＣＳ１８０）为ＣＩＢＡＣＯＲＮＩＮＧ产品。 １．２方法 1.2.1ＣＥＡ ＩＦＭＡ（１）固相C17和Eu3+－##3+3+C５０制备：将C17单抗用５０nmol/L Na2CO3-NaHCO3 释至１０mg/L。每孔加200ul,4℃放置过夜。Eu3+－C５０制备参照Eu标记盒进行。每个C５０IgG上连接了13个Eu，产率3+3+达%。（2）测定方法：用含8mmol/L NaCI,%BSA,%牛IgG，50umol/LDTPA,LTween-80 和 %NaN3的50mmol/L Tris-HCI 为反应冲液，以含水mmol/L NaCI,L Tween-80和%NaN3的上述缓冲液为洗涤液.采用固相二步顺序夹心法建立CEA-IFMA,即在包被有C17的96孔微孔板上,每孔依次加入25ul CEA参考标准或待测血清及200ul反应缓冲液,37℃振荡孵育2h后,用洗涤液洗4次。再加200ul1:1000稀释的Eu3+－C５０，37℃孵育1h，洗涤6次，加入增强液200ul,370170反应5min,荧光检测。全部过程在Auto DELFIA1235上自动完成。 1.2.2 AFP IFMA (1)固相C47和Eu3+3+－C137制备：方法同上，每个C137IgG上连接了个Eu，产率达%。（2）测定方法：反应缓冲液和洗涤液同上。采用固相二步顺序夹心法建交AFP-IFMA，C47包被板每孔依次加入25ul AFP参考标准或待测血清及200ul反应缓冲液，37℃孵育1h后，加200ul：1000稀释的Eu3+－C５０，孵育1h。后续方法同上。 1.2.3 CEA和AFP CLIA 参照药盒说明书，全部过程均在ACS180上自劝完成。 2 结 果 IFMA 以零剂量测量结果均值加上代入标准曲线分析,CEA IFMA的灵敏度为90ng/L；AFP对本法无交叉反应，CA-19-9的交叉反应可达%；方法的批内和批间CV分别为%和%。平均回收率为%，可测范围为～L。 AFP IFMA 以零剂量测量结果均值加上代入标准曲线分析,AFP IFMA的灵敏度为43ng/L；CEA、CA-12-5、CA-15-3和CA-19-9对方法无交叉反应；方法的批内和批间CV分别为%和%。平均回收率为%；可测范围为～1210ul/L。 IFMA与CLIA同步比较 137例正常人经CEAMA和CLIA测量,结果高度相关(r=。148例正常人经AFP IFMA 和CLIA测量，结果相符（r=）。 3 讨 论 以往超微量免疫分析技术应用的普遍问题是稳定性难以满足于临床工作的需要。鉴于放射性同位素示踪剂自身衰变或保存条件苛刻及自分解变性失活等原因，对于RIA和IRMA等方法，每次分析，即使单样品检测也必须做标准曲线相对测量的依据。EIA本身方法学的原因，不能完全定量。我们建立的AFP和CEA IFMA同批试剂连续5个月临床应用分析，标准曲线基本重合，无明显漂移。可以用同批试剂单次标准曲线作为今后分析的固定参考曲线。CIBA-CORNING的CLIA试剂盒也同样可重复且稳定。就IFMA和CLIA经临床同步比较，结果相关性好。同时我们也与我们自己的IRMA比较，结果也高度相关，说明上述两种方法可取代以往的AFP和CEA分析方法。从方法学的考核情况看，多数指标与IRMA类同，但方法学稳定性显着优于IRMA。就IFMA与CLIA临床比较方面，后者检测速度明显优于前者，可作临床急诊诊断。而前者适合大批量的样品检测，稳定性更高，可测范围更宽，理论分析灵敏度更高。尤其是镧系元素多标记技术的研究开发，使IFMA有可能成为象生化分析仪样的一次分析多个分析结果产生的前景。 ［参考文献］ ［1］ NIH consensus antigen:It is role as marker in the management of cancer ［j］.Cancer Res,1981,41:2017. ［2］Suonpaa MU,Lavi JT,Himmila new sensitive assay of human alphl-fetoprotein using time-resolved fluorescence and monoclona antibodies ［j］.Clin Chim Acta,1985,145,341-348 ［3］Rosalyn S, radioimmunoassay［j］.中华核医学杂志，1989，9：1 ［4］［3］ ［4］ 黄 飚，浦洪波，朱寒珍，等.癌胚抗原试管固相免疫放射分析［j］.核技术,1995,18:699 甲胎蛋白时间分辨荧光免疫分析 黄飚 肖华龙 朱利国 谭成 蔡刚明 金坚 近年发展的时间分辨荧光测量技术以稀土离子为示踪材料，具有测量灵敏度高、操作简便、示踪物稳定、定量分析量程宽、无放射性污染和应用范围广泛等优点。我们采用时间分辨荧光测量技术，建交了AFP时间分辨荧光免疫分析（ time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA）。 一、 材料与方法 1、 材料与试剂：抗AFP单克降抗体A137和A47由无锡第二制药厂提供。Eu3+标记盒、Eu3+发光增强液、AFP TRFIA药盒和AFP参考标准，EG＆G-Wallac产品。CA199、CA125和CA153参考标准，CIBACORNING产品。AFP质量控制血清（L：M：62～93ug/L；H：～L）,中国药品生物制品鉴定所产品。全自动TRFIA检测仪（Auto DEL FIA1235）为EG＆G-Wallac产品。 2、 固相抗体制备：将A47单抗用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3 缓冲液稀释至10ng/L的包被液，微孔板各孔加200ul，4℃放置过夜。BSA封闭后真空抽干，板条密封后置20℃冷冻保存。 3、 Eu3+- A137制备：参照Eu3+标记盒说明书操作。取溶解于L NaCI的50mmol/L Na2CO3-NaHCO3 缓冲液A137（2g/L）500ul加入含的Eu3+-N2-［p-异氰酸-苄基］-二乙烯三胺四乙酸（Eu3+-DTTA）冻干粉的小瓶中，30℃磁力搅拌反应20h。反应液经用80mmol/L Tris-HCI 缓冲液平衡的Sepharose CL-6B柱（1cm×40cm）层析，A280监测收集蛋白峰。 4、 测定方法：采用平衡法建交AFP-TRFIA，即在包被在A47的96孔微孔板上，每孔依次加入25ul AFP参考标准或待测血清， 200ul以反应缓冲液1：1000稀释的Eu3+- A137，25℃振荡孵育1h后，用洗涤液洗涤6次。再加增强液200ul,25℃振荡反应5min，荧光检测。全部过程均在Anto DELFIA 1235上自动完成，软件设置由本所自编。 5、 数据分析和统计处理：AFP-TRFIA标准曲线由Anto DEFIA 1235自带的Log-Logit函数处理。精密试图和可测范围分析用吴德福IRMA数据处理软件。统计党处理用t检验。 二、 结果 1、 Eu3+- A137的理化和免疫学鉴不定期：Eu3+- A137以EG＆G-Wallac提供的Eu3+标准为参考，平均每个A137IgG上连接了个Eu3+，产率达%。选择AFP参考标准高点 （1000ul/L）, Eu3+- A1371:1000稀释，进行TRFIA，Bmax/T为%.与低点（1ug/L）的发光计数差达2个数量级以上。被测物和反应发光计数基本成算术级数正比关系。 2、 AFP=TRFIA的考核：经Log-Logit函数处理程序处理得AFP-TRFIA标准曲线。（1）方法的特异性：将CEA、CA199、CA125和CA153分别配成10～500U/ml、～409U/ml、～732U/ml和～243U/ml一系列不同浓度，代替标准曲线中的AFP参考标准。在上述范围内，CEA、CA199、CA125和CA153对AFP-TRFIA均无均交叉反应。（2）精密度和回收率：本方法的批内和批间CV分别为%和%，8批标准曲线的ABCV均小于，精密度图显示可测范围为～1210ul/L,回收率为%。（3）灵敏度和稳定性：以零剂量点发光值均值加2s后的发光值在标准曲线上得到的相应值为L。8条不同时间进行的AFP-TRFIA的效点均值ED20、ED50和ED80分别为（±）ul/L、（±）ul/L和（±）ul/L。 三、 讨论 TRFIA 测量仪已进入第在代，分析技术已实现高度自动化。我们所建方法适于测量