内容发布更新时间 : 2024/6/26 12:14:12星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

蛋白质与酶工程重点

1.蛋白质工程：以蛋白质结构与功能的关系研究为基础，利用基因工程技术或化学修饰技术对现有蛋白质加以改造，组建成新型蛋白质的现代生物技术。

2.酶工程：利用酶、细胞器或细胞的特异催化功能，通过适当的反应器工业化生产人类所需产品或达到某种特殊目的的一门技术科学。

3.酶工程研究的主要内容：1）化学酶工程 2）生物酶工程 3）固定化酶与细胞 4）酶反应器与传感器 5）酶的非水相催化

4.蛋白质的融合：将编码一种蛋白质的部分基因重组到另一种蛋白质基因上，或将不同蛋白质基因的片段组合在一起，经基因克隆和表达产生新的融合蛋白。

5.蛋白质的融合的作用：1）用于表达产物的分离纯化；2）提高表达产物的溶解度；3）提高蛋白质稳定性。

6.蛋白质晶体学：利用X射线衍射技术，进行生物大分子结构研究的工程，是结构生物学的一个重要组成部分。

8.定点突变：通过分子克隆手段定点的改变特定基因的局部核苷酸序列，通常被用来研究蛋白质的功能结构以及用于目的蛋白的改造。 10.酶工程的研究范围：

1）各类自然酶的开发和生产； 2）酶的分离纯化和鉴定技术； 3）固定化技术；

4）利用其他的生物技术领域交叉渗透； 5）多酶反应器的研制和应用。 11.酶的稳定性和稳定化： （一）引起酶失活的原因：

1）酶的活性中心一些特定氨基酸残基被化学修饰，使酶活性丧失（微观）； 2）外部环境的影响，酶活性中心出现空间障碍，使其不能与底物结合； 3）酶的高级结构发生变化（螺旋、折叠发生变化）； 4）多肽链的断裂（很强烈）； （二）酶的稳定化：

1）低温保存（酶的本身不易变性，不易使其他酶把目的蛋白降解）； 2）添加盐类（高浓度(NH4)2SO4）； 3）添加底物辅酶等配体；

4）添加强变性剂（保护一级结构，使用时可复活）； 5）结晶化。

12.微生物作为酶源的优越性： 1）容易获得酶需要的酶类； 2）容易获得高产菌株； 3）生产周期短； 4）生产成本低； 5）生产易管理；

6）提高微生物产酶的途径比较多。

13.固定化酶：指在一定空间呈封锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。

14.固定化酶的优点：

1）极易将固定化酶与产物和底物分开；

2）可以在较长时间内进行反复的分批反应和装柱连续反应； 3）在大多数情况下能够提高酶的稳定性； 4）酶的反应过程能加以严格控制；

5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 6）较游离酶更适合于多酶反应；

7）可以增加产物的收率，提高产物的质量；8）酶的使用效率提高、成本降低。 15.固定化酶的缺点：

1）固定化时酶活力有损失；

2）增加了生产的成本，工厂初始投资大；

3）只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物；

4）与完整的菌体相比不适合多酶反应，特别是需要辅因子的反应； 5）胞内酶必须经过的分离手续。 16.固定化酶的制备原则：

1）必须注意维持酶的催化活性和专一性； 2）固定化应有利于生产的自动化和连续化；

3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍煤与底物的接近，以提高产品产量； 4）酶与载体必须结合力牢固，使固定化酶能够回收，储藏利于反复使用；

5）固定化酶应有最大的稳定性，所选的载体不与废物产物或反应液发生化学反应； 6）固定化酶成本要低，利于工业使用。 17.酶固定的方法： （一）非共价结合法：

1）结晶法：适用于酶活性低的酶，结晶后浓度变化大，在不断的连续使用中没有所损耗； 2）分解法：将酶制成干粉，将其分散于水中不溶相中，即使干粉悬浮于溶剂上，优点：回收较方便，缺点：干粉易吸水，颗粒变大，活性降低，在有机溶剂中酶活力会受到影响； 3）物理吸附法：酶被物理吸附于不溶性载体的一种方法；优点：酶活性中心不容易被破坏，高级结构变化少，酶活力损失小，也适用于固定化细胞；缺点：酶与载体相互作用弱，酶易脱落；

4）通过离子键结合到水溶性载体上；优点：操作简单、条件温和、高级结构及活性中心不能被破坏，也适用于固定化细胞；缺点：载体与酶的结合力较弱，阴阳离子或阳离子缓冲液，离子浓度影响较大、酶较易从载体上脱落； （二）化学结合法：

1）共价结合法：酶与载体共价结合；方法：将载体有关的基因活化，然后与酶有关的基因发生偶联反应，在载体结合比较牢固，一般不会固定底物浓度变化而改变；缺点：反应条件较激烈，往往会引起高级结构的变化，破坏活性中心，只适用于酶的固定化，不适用于细胞的固定化；

2）交联法：就使用多功能试剂或者是双功能试剂，使酶与酶或微生物与微生物细胞之间交联的固定化方法，一般会通过降低交联剂浓度及反应时间保持酶活力； （三）包埋法：

1）网格型：将酶或微生物包埋在高分子凝胶的细微网格中，此法是固定化微生物细胞用得较多的方法；优点：不需要与酶蛋白发生结合反应，酶活回收率较高；

2）微胶囊型：把酶分子包在一个胶囊中，高分子膜为半透型的，此胶囊不渗透，可以在一些无水的有机相中存在。 18.固定化酶的性质：

（一）固定化后酶活力的变化：

原因：1）酶分子在固定化过程中空间构象有所变化，甚至影响活性中心的氨基酸； 固定化后酶分子空间自由度受到限制，直接影响到活性中心对底物的空位作用； 内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻力；

包埋时，酶被高分子半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近； 固定化对酶稳定性的影响： 热稳定性提高；

2）对各种有机试剂及酶试剂稳定性提高；

3）对不同pH值的稳定性，对蛋白酶的稳定性，贮存稳定性和操作稳定性都有影响；

4）固定化酶稳定性提高的原因：固定化酶与载体可以多点连接，可以防止蛋白酶分子伸展变形；固定化后酶的活力可以缓解释放；可以抑制酶的自降解； （三）最适温度变化----升高；

（四）最适pH值变化：范围扩宽；

（五）Km（米氏常数的变化的变化----变小，亲和力提高）。 19.固定化方法：

1）将辅酶和酶共同的固定在同一个载体上，可得到一个永久性不需外加辅酶的体系； 2）将辅酶直接固定在酶分子上。

20.细胞固定化：被限制自由移动的细胞，即细胞受到物理、化学等因素的约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性，并且有能被反复连续使用的活力。 1.细胞固定化的优缺点：

优点：1）固定化细胞保持了细胞内酶系的原始状态和天然环境，因而更稳定； 保持胞内原有的多酶系统，对于多步催化优势更加明显，不需要辅酶再生；

对固定化增殖细胞发酵更具明显优势；固定化细胞密度大，可增殖，缩短发酵生产周期；发酵稳定性好，可较长时间的反复连续使用；发酵液中含的菌体较少有利于产品分离纯化，提高产品质量；

缺点：1）细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物；

细胞膜、细胞壁，还有载体的存在都会形成一种扩散限制的作用； 3）载体形成的孔隙大小影响到高分子底物的通透性。

2.化学修饰：凡是通过化学基因的列入或除去而使蛋白质的共价结构发生改变，我们把这种现象称为化学修饰。

3.蛋白质功能基反应性影响因素：1）微区的极性：2）氢键效应；3）静电效应；4）位阻效应。

4.酶蛋白功能级的超反应性：指蛋白质的某个侧链基因与个别试剂能发生迅速反应。

5.影响超反应性的因素：1）改变蛋白质功能的pK值；2）蛋白质功能基具有较大的反应性；3）通过静电相互作用来吸引试剂并使其具有适当的取向；4）试剂与靠近修饰部位的蛋白区域之间的立体化学适应性。

6.修饰剂反应性的决定因素：1）选择吸附；2）静电相互作用；3）位阻因素；4）催化因素：5）微区极性（局部环境的极性）。 7.修饰反应专一性的控制： （一）试剂的选择：

1）对氨基酸的修饰有几种情况：

a.修饰所有的氨基而不修饰其他基因； b.反修饰α氨基；

c.修饰具有催化活性的氨基；d.改变蛋白质的带电状态和溶解性，改变蛋白质的带电状态要选择能够在中性条件下带最大电荷量的试剂，改变蛋白质的溶解性反应在水中进行，选择化