β-N-乙酰葡萄糖苷酶(NAG)检测试剂盒(PNP微板法)-南京廖华答案网

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内容发布更新时间 : 2024/6/16 17:59:01星期一下面是文章的全部内容请认真阅读。

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β-N-乙酰葡萄糖苷酶检测试剂盒(PNP微板法)

简介：

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)可水解β-N-乙酰氨基葡萄糖苷，也能水解β-N-乙酰氨基半乳糖苷，该酶广泛存在于多种组织、体液、细胞，是溶酶体中的一种酸性水解酶，其测定方法有比色法和荧光光度法。

Leagene β-N-乙酰葡萄糖苷酶检测试剂盒(PNP微板)(NAG Colorimetric Assay Kit)检测原理是在酸性条件下NAG可使底物对硝基酚-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷水解，释放出游离的对硝基酚(p-nitrophenol，PNP)，在碱性条件下p-nitrophenol呈黄色产物，产物黄色越深，说明β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性越高，反之则酶活性越低，通过酶标仪测定处吸光值，据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中的β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

组成：

自备材料：

1、 96孔板 2、恒温箱 3、酶标仪

编号名称 TE0061 50T 7.5ml 1支 0.05ml 0.05ml 1ml Storage 试剂(A): NAG Assay buffer 试剂(B): 4-NAG 试剂(C): Alkaline buffer 试剂(D): p-nitrophenol(10mM) 试剂(E): ddH2O 使用说明书 4℃ -20℃ 避光 4℃ -20℃ 避光 RT 1份操作步骤(仅供参考)：

1、配制检测工作液：

① 配制显色工作液：取出4-NAG，恢复至室温后溶解于NAG Assay buffer，混匀，

冰上预冷备用。新配制的显色工作液应在10天内用完。

② 配制标准品工作液：取出p-nitrophenol(10mM) 恢复至室温后，取溶解于ACP

Assay buffer，使p-nitrophenol达到。

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2、制备标准曲线：

① 按照下表稀释系列标准品溶液。

1 0.5 9.5 10 2 1 9 20 3 1.5 8.5 30 4 2 8 40 5 2.5 7.5 50 6 3 7 60 p-nitrophenol(3mM)(μl) ddH2O(μl) 相当于NAG单位(U/L) ② 以试剂空白对照(以ddH2O代替标准液)调零，读取系列标准溶液的处吸光值即

A401。该步骤可同待测样品一起操作。

③ 以每个浓度的标准品A401为x轴，以对应的p-nitrophenol浓度为y轴，用Excel

制作p-nitrophenol浓度对A401值的标准曲线。

3、准备样品：

① 细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，低速离

心取上清，冻存，用于β-N-乙酰葡萄糖苷酶的检测。

② 血清和尿液样品：血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通

常也可以直接用于测定，冻存，但为了消除样品本身颜色的干扰，需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。

③ 高活性样品：如果样品中含有较高活性的β-N-乙酰葡萄糖苷酶，可以使用原有的裂

解液或PBS等进行稀释，也可以采用NAG Assay buffer稀释。

4、加样：按照下表设置96孔板样品空白对照、标准品、待测样品，溶液应按照顺序依次

加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的酶活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。样品的检测最好能设置平行孔。 5、按

待测样品 ddH2O 样品空白对照孔 8μl 37℃温育平衡3min。显色工作液(37℃提前温育) 50μl 50μl 50μl — — 8μl — 标准品孔待测样品孔 37℃孵育15～20min。 Alkaline buffer 标准品工作液 160μl — 160μl 8μl 160μl — 照

上表每孔加入相应待测样品或标准品后，温育平衡。

6、加入显色工作液，轻轻混匀，37℃孵育，加入Alkaline buffer显色。

7、用ddH2O调零，读取待测样品孔和空白调零孔的吸光度(即A待测和A空白)，如果无法

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检测，亦可检测吸光度，一般应数小时内检测完毕。A待测-A空白的差值为实际的吸光度，用该差值与标准曲线进行对比。

计算结果：β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性单位的定义：1L样品与底物在 37℃条件下，每分

钟水解4-NAG显色底物产生1微摩尔p-nitrophenol所需的β-N-乙酰葡萄糖苷酶的量定义为一个酶活力单位(1U/L)。根据酶活性定义，计算出样品中的β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性。

注意事项：

1、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。

2、建议每次测定时都做标准曲线，以使标准更准确，另外标准品需避免反复冻融。 3、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检

测体积，尽量采用小体积的比色杯。

4、用窄带宽分光光度计，吸光度至1.0或酶活性达90U/L时仍为直线；用用窄带宽分光

光度计，吸光度至0.6或酶活性达60U/L时仍为直线。超出此范围应用生理盐水稀释样品后重新测定，结果乘以稀释倍数。

5、一支显色工作液配制后需当日使用完毕，因此请注意适当多准备一些样品一起检测。 6、尿β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性以肌酐比值“NAG(U/gCr)”计算酶排出率，这样既不因

为尿浓缩或稀释的影响而改变，又可不需留24h尿

7、 p-nitrophenol溶液对人体有害，反应终止液有腐蚀性，请小心操作。

8、如果希望进行酶活性的绝对定量，进行酶反应时应精确计时，此时推荐采用孵育30min

或更长时间，以减小操作过程中的时间误差。

9、待测样品中酸性磷酸酶活性较低时，可适当延长孵育时间至30min。

有效期：12个月有效。