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姓名吴月婷学号13990115班级序号 6 实验日期 2015-11-10 室温 18℃

实验8 细菌的生理生化鉴定

1 实验目的

1) 了解微生物对大分子物质水解的原理和方法，了解糖发酵及IMViC的原理和方法。 2) 鉴定未知菌对淀粉、明胶的水解能力。

3) 鉴定未知菌糖发酵试验、 IMViC 试验中的能力。

2 实验原理

1) 大分子物质的水解试验

微生物不能直接利用大分子的淀粉、蛋白质和脂肪，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过加水裂解大的物质为较小的化合物，使其能被运输至细胞内。如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖；脂肪酶水解脂肪为甘油和脂肪酸；蛋白酶水解蛋白为氨基酸等。淀粉遇碘液会产生蓝色，但细菌水解淀粉的区域，用碘测定不再产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。明胶是由胶原蛋白经水解产生的蛋白质，在25°C以下维持凝胶状态，呈固体形式存在，在25°C以上明胶会液化。有些微生物能产生明胶酶，水解明胶而使之液化。石蕊在酸性条件下为粉红色，在碱性条件下紫色，被还原时为无色。 2) 糖发酵试验

糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异。有些细菌能分解某种糖产生有机酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢气、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖并产气。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色（pH6.8）变为黄色（pH5.2）。气体的产生可由倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 3) IMViC试验

吲哚试验是用来检测吲哚的产生。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。大肠杆菌吲哚试验为阳性。

甲基红试验是用来检测葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色（pH6.3）变为红色（pH4.2），即甲基红反应。大肠杆菌为阳性。

V-P试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏-普反应阳性；不产生红色化合物者为阴性反应。大肠杆菌为阴性。

柠檬酸盐试验是用来检测细菌利用柠檬酸的能力。有些细菌能分解柠檬酸形成CO2，由于培养基中钠离子的存在而形成碳酸钠，使pH升高，加入1%麝香草酚蓝指示剂时，培养基由绿色变为深蓝色。大肠杆菌为阴性。

3 步骤

1) 大分子物质的水解试验 ① 淀粉水解试验

姓名吴月婷学号13990115班级序号 6 实验日期 2015-11-10 室温 18℃

在淀粉培养基上接种实验菌，37℃培养1d后，用碘液进行检验，观察是否有透明圈出现。 ②明胶水解试验

取明胶培养基试管，用接种针穿刺接种实验菌，大肠杆菌为对照，37℃培养2d后，观察明胶水解情况。 ③石蕊牛奶试验

取石蕊牛奶培养基，接种实验菌，大肠杆菌为对照，37℃培养2d后，观察明胶水解情况。 2) 糖发酵试验

取糖发酵培养基，接种实验菌，大肠杆菌为对照。接种后，清缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。置37℃培养24~48h。观察试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。 3) IMViC试验 ① 吲哚试验

在蛋白胨水培养基接种后，37℃培养2d，在培养基内加8滴乙醚，振荡数次，静置1～3min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入5滴吲哚试剂，放入保温箱中保温15min，观察：在乙醚和培养物之间有无红色环状物产生。 ② 甲基红试验

葡萄糖蛋白胨水培养基接种，37℃培养2d，将培养物一分为二，1支培养物内加入甲基红试剂2滴，观察颜色的变化：培养基变为红色者为阳性，变黄色者为阴性。 ③ V-P试验

葡萄糖蛋白胨水培养基接种，37℃培养2d，将培养物一分为二后，另1支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入5～10滴40%KOH，然后加入等量的5%α-萘酚，用力振荡，再放入37℃温箱中保温15～30min，以加快反应速度。观察颜色变化：培养物呈红色者，为伏-普反应阳性。 ④ 柠檬酸盐试验

接种柠檬酸盐培养基，37℃培养2d，观察柠檬酸盐斜面培养基上有无细菌生长和是否变色。

4 结果与分析

1) 大分子物质的水解试验

试验结果如图1所示。在淀粉水解试验中，经碘液染色后，菌落周围出现一圈透明圈，表明该菌种具有水解淀粉的能力。在明胶水解试验中，实验菌和大肠杆菌都能够使明胶液化，表

图1 大分子物质水解实验结果

E:大肠杆菌；X:未知实验菌种

明实验菌具有水解明胶的能力。在石蕊牛奶试验中，石蕊呈现白色，被还原，表明实验菌具有还原石蕊牛奶的能力。 2) 糖发酵试验

姓名吴月婷学号13990115班级序号 6 实验日期 2015-11-10 室温 18℃

糖发酵实验结果如图2所示。实验菌试管中上面紫色，下面黄色，没有气体产生，而大肠杆

图2 糖发酵试验结果

E:大肠杆菌；X: 未知实验菌种.

菌试管为黄色，管中有气体产生，表明大肠杆菌能分解和利用葡萄糖，产气；实验菌能利用葡萄糖，但利用率没有大肠杆菌高，不产气。 3) IMViC试验

IMViC试验结果如图3所示。在吲哚试验中，实验菌和大肠杆菌都出现了红色圈，表明实验菌吲哚反应为阳性。在甲基红试验中，液体呈现红色，表明实验菌的甲基红反应为阳性。在V-P试验中，实验菌和大肠杆菌都没有出现红色，表明实验菌的V-P试验为阴性。在柠檬酸酸盐水解试验中，实验菌和大肠杆菌的培养物都没有变成深蓝色，表明实验菌不能利用柠檬酸盐，反应为阴性。

图3 IMViC试验结果

E:大肠杆菌；X:未知实验菌.

表1 生理生化试验结果

试验类型 水解淀粉 水解明胶 还原石蕊牛奶 利用葡萄糖 葡萄糖产气 吲哚试验 甲基红试验 V-P试验 柠檬酸盐试验

大肠杆菌

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实验菌 + + + + - + + - -