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细胞生物学教学大纲

第一章 绪论

第一节 细胞生物学的研究对象和范围 细胞生物学是从细胞整体、超微结构和分子水平上研究细胞的结构和生命活动规律的学科。 细胞生物学研究对象

细胞——是一切生物的基本结构单位，它是由膜围成的能独立进行繁殖的最小原生质团。 细胞生物学研究范围 ?细胞的结构

?显微结构：在光学显微镜下细胞的结构

?亚显微结构：超微结构, 电子显微镜下细胞的结构 ?细胞的功能

?物质的吸收与分泌、合成与分解、增殖与分化、衰老与死亡、信息传递与转导以及遗传与变异等等 第二节 细胞生物学的发展简史 ?细胞的发现

?细胞学说的创立和细胞学的形成 ?电镜下的细胞和细胞生物学的兴起 ?分子细胞生物学的出现 细胞的发现

?最早发现细胞的是Robert Hooke

?1665年从木栓中发现蜂巢状小室──细胞。

?创造了第一架有科研价值的显微镜，放大倍数40~140倍

细胞的发现

?第一次（1674年）观察到活细胞的是A.V.Leeuwenhoek ?发现了池塘中的原生动物 ?观察到了哺乳动物的精子

?自制显微镜，放大倍数达500倍 细胞学说的创立和细胞学的形成

?1838年，德国植物学家Schleidon提出：所有的植物体都是由细胞组合而成的

细胞学说的创立和细胞学的形成

?1839年，德国动物学家T.Schwann认为：动物体也是由细胞组成的，并肯定一切生物体都是由细胞组成的 细胞学说的创立和细胞学的形成

?二人的观点就是著名的―细胞学说‖（cell theory)， M.Schleidon和T.Schwann同时成为细胞学说创始人。 ?1855年，德国病理学家R.Virchow提出：―细胞来自细胞‖，对细胞学说做了重要补充。 ―细胞学说‖主要内容

?细胞是多细胞生物的最小结构单位，对单细胞生物来说，一个细胞就是一个个体；

?多细胞生物的每一个细胞即是一个活动单位，执行特定的功能；

?细胞只能由细胞分裂而来。 原生质理论

?1835年，E.Dujardin 发现了动物细胞中的粘液质，将其称为―肉样质‖(sarcode)； ?1840年，Purkinje发现了植物细胞中的物质，将其称为―原生质‖（protoplasm）；

?原生质学说——细胞是有膜包围的原生质团

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细胞学的经典时期 ?细胞结构的重要发现

?1880年，T.Boveri发现中心体 ?1898年，C.Benda发现线粒体 ?1898年，C.Golgi发现高尔基体 ?细胞功能的重要发现

?1885年，W.Flemming发现并提出有丝分裂 ?1905年，J.E.Moore等发现并提出减数分裂 细胞学的形成

?O.Hertwig于1892年发表了《细胞与组织》的著名著作 ，这一著作标志着细胞学（Cytology）作为一门独立的生物学科的建立。

? Wilson,E.B.于1896年发表了名为《发育和遗传中的细胞》一书，成为细胞学史上第一部有系统的细胞学。 电镜下的细胞和细胞生物学的兴起

?1933年，德国科学家Ruska（鲁斯卡）在西门子公司（Siemens）设计制造出世界上第一台电子显微镜，大大提高了显微镜的放大倍数。 分子细胞生物学的出现

?20世纪60年代，人们发现基质中有微管、微丝的存在，并构成纵横交错的骨架，总称细胞骨架(cytoskeleton）； ?细胞骨架的发现是细胞超微结构研究方面的重大进展。同时由于分子生物学的发展，将细胞生物学带入分子时代。

第三节 细胞生物学的研究进展

?对生物膜、线粒体、核糖体、细胞骨架以及染色体等的分子结构和功能研究方面取得了深入进展。

?在基因组结构和基因表达与蛋白质合成方面取得了大量成果。

?细胞工程领域硕果累累 ?单克隆抗体制备

?转基因动物、转基因植物的开发与利用 ?克隆技术的研究

?胚胎与组织干细胞研究的广泛开展

第二章 细胞生物学研究方法

第一节 形态结构 一、光学显微镜

（一）普通光学显微镜

影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率

分辨率是指显微镜能将相近的两个质点分辨清楚的能力

分辨率（resolution）公式：D= 0.61? / N.A.

? D—— 分辨率 ?—— 光波波长 N. A. —— 镜口率（数字孔径） N. A. =N ? Sin ? /2 （二）特殊显微镜暗场显微镜

?原理：显微镜加装特殊装置，使直射光不能进入物镜，只允许被标本反射、衍射的光线进入物镜

?特点：视野的背景是暗的，样品是的边缘是亮的。 特殊装置：在聚光器中加装中央遮光板或者使用暗视野聚光器

相差显微镜（ phase contrast microscope） 二、电子显微镜

?电子显微镜以电子束代替了可见光，大大提高了显微镜的分辨率，可以观察细胞的亚显微结构 ?电子束的波长与电压成反比，波长极短 ?例如，电压为6万伏，则?=0.0488埃 ?比最短的可见光4000埃约小10万倍 电镜的基本构造：

电镜与光镜的主要区别：

光学显微镜 电子显微镜 光源 可见光 电子束 介质 空气（香柏油） 真空 聚光镜 光学透镜 电磁透镜 分辨力 0.2um 0.1nm 放大倍数 1000倍 百万倍 电子显微镜主要种类：

?透射式电子显微镜(TEM) 主要用于观察标本内部细微结构

?扫描式电子显微镜（SEM) 主要用于观察标本表面形态结构

?扫描隧道显微镜（STM）

?电镜技术：冰冻断裂和冰冻蚀刻 冰冻断裂和冰冻蚀刻电镜技术：（freeze—fracture;freeze—etching） ?目的：主要用于研究生物膜结构 ?主要步骤：

?冰冻标本（-1000C干冰或-1960C液氮），冷刀断开标本（冰冻断裂），升温，冰升华，断裂面结构暴露（蚀刻），表面喷一层蒸汽碳和铂，将组织溶掉，碳和铂的膜称复膜（replica），电镜下观察复膜，复膜构造=标本构造 扫描隧道显微镜（STM）（scanning tunneling microscope）

?可观察晶体表面原子图像

?主要部件扫描探针由钨丝或白金丝制成，直径几个埃 ?原理：电子在样品与探针之间（距离几个埃）转移可形成隧道电流，当

?优点：分辨力高；三维图像；电压低（2mV—2V）；不用真空（常压、液态）；速度快。 第二节 生物化学分析 一、组织化学法

*利用染色的方法进行原位分析

* 福尔根（Feulgen）反应：鉴定DNA *PAS反应（高碘酸席夫反应）：鉴定多糖类物质

? 二者皆有醛基与Schiff试剂反应，生成红色化合物 二、免疫细胞化学

?特异蛋白抗原的定性与定位

?方法：原位分析 ；体外蛋白质分析★ （一） 原位分析 ：免疫反应 ：

?直接法：Ag+Ab*?镜检；间接法：Ag+Ab1+ Ab2*?镜检。*代表标记物 标记物可以为多种：

?荧光素─免疫荧光技术或称荧光抗体法，酶─酶标抗体法，放射性同位素标记—放射自显影，铁蛋白标记，免疫胶体金技术

（二）体外蛋白质分析

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?蛋白质印迹法（Western blotting） ?技术路线 ： （图）

?样品制备—样品分离—样品转移—免疫反应——检测 ?蛋白质由SDS聚丙烯凝胶?硝酸纤维素膜转移的过程即为印迹（blotting） 三、显微光谱分析技术 ?定量细胞化学分析技术

?细胞显微分光光度术（Microspectrophotometry） ?流式细胞术（Flow Cytometry）★ 流式细胞术

*仪器：流式细胞计—flow cytometer *特点：细胞是高速运动的 *主要应用：

用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞；分离DNA含量不同的中期染色体；混合细胞分离 。

五、超离心技术（ultracentrifugation）

?高速离心：10000—25000r/min；超速离心：转速大于25000r/min

? 沉降系数（ “S”—Svedberg unit）: 单位离心场中溶质分子的沉降速度 。1S 相当于1?10-13s

? 离心目的：分离细胞器与生物大分子及其复合物 离心种类：

?分析离心：用于分析和测定制剂中的大分子的种类和性质等

?制备离心

?差速离心：分离密度不同的细胞组分

?密度剃度离心：精细组分或生物大分子的分离（介质蔗糖、氯化铯）

六、分子杂交技术

?细胞内特异核酸的定性定位 ?原位杂交

?光镜水平的原位杂交技术——同位素标记或荧光素标记的探针

?电镜水平的原位杂交技术 —生物素标记的探针与抗生物素抗体相连的胶体金标记结合

?体外分析核酸的主要方法：Southern blotting又称DNA印迹法；Northern blotting又称RNA印迹法 原位杂交（in situ hybridization）

?分子杂交（molecular hybridization）是利用DNA高温变性、低温复性原理形成杂交分子的过程 ?杂交分子形式：DNA—DNA；DNA—RNA；RNA—RNA ?原位杂交是在分子杂交基础上建立起来的 七、PCR技术

?聚合酶链式反应；引物：寡核苷酸链；原料：d NTP；酶：DNA聚合酶（耐高温） 第三节 细胞生理学技术 1、膜电位检测技术

细胞内外存在电位差（20~100mV）称为膜电位，膜电位的变化反应了细胞的生理变化 2、膜片钳位记录技术

主要用于检测单个特定离子通道性 质及变化

3、细胞电泳

细胞表面带有许多电荷，因而可以在外加电场的作用下移动

第四节 实验操作技术

一、细胞培养（cell culture） ?动物细胞培养 ?植物细胞培养

（一）动物细胞培养 细胞培养主要方式

?克隆培养（clonal culture）：克隆又称无性繁殖系或无性系

?群体培养（mass culture）

?体外培养细胞生长特点：单层细胞培养 贴壁生长；接触抑制现象 ?转鼓培养法

?为了大量获取细胞而使细胞始终悬浮不贴壁的培养方法 细胞培养相关概念：

?原代培养（primary culture）：从机体中取出细胞后直接培养，得到原代细胞（一般指分裂10代以内的细胞）。 ?分离细胞的主要方法★ ?传代培养（sub—culture）：适合在体外进行的持续性培养，传代培养的细胞称传代细胞。

?细胞株（cell strain）在培养过程中仍然保持其特征（二倍体）及接触抑制的传代细胞。

?细胞系（cell line）在培养条件下发生突变后可以无限增殖的细胞群，接触抑制丧失。

? 例：HeLa细胞系；CHO细胞系

?动物细胞的无血清培养：在培养液当中不加血清，从而去除因血清成分复杂对实验结果的影响。 ?细胞培养常需要从组织中分离细胞 ?分离细胞的主要方法

?酶法：动物组织—胰蛋白酶；植物组织—果胶酶

2+

?非酶法：EDTA与Ca螯合 （二）植物细胞培养 ?植物细胞—再生植株 ?植物细胞培养分为：花药或花粉培养；胚和胚株培养； 颈顶端培养；叶肉细胞培养；原生质体培养 1、花药或花粉培养

?花粉 培养液 愈伤组织 分化培养基 长出茎叶另一分化培养基 根形

花盆

成 植株 5、原生质体培养

?植物细胞 纤维素酶、果胶酶去壁 原生质体 高渗培养基 生成细胞

分化培养基 壁 愈伤组织……

二、显微操作术：micromanipulation 显微操作

仪

三、细胞融合

?细胞杂交技术（cell hybridization）

?单克隆抗体技术（monoclonal antibody） ?细胞拆和

?1、物理法：针、管、光；2、化学法：细胞松弛素B 核体（小细胞）；胞质体 四、核型与染色体显带 ?核型

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?染色体显带Q带：喹丫因染色；G带：吉姆萨（Giemsa）染色；C带：染着丝粒R带：“反带”；T带：丫啶橙，“端粒带”；N带：Ag染法 第三章 细胞的基本概念 第一节 细胞的基本特征 *细胞的基本概念

?细胞：有膜包围的能独立进行繁殖的最小原生质团 ?细胞质：细胞核以外，细胞膜以内的原生质

?细胞器：细胞质中在光学和电子显微镜下能显示 出的具有一定形态特点并执行特定功能的结构

?原生质：指活细胞的全部活物质，包括质膜，细胞质和细胞核

?原生质体：由脂双层膜包围着原生质的活细胞，植物细胞除细胞壁以外的部分

*细胞进行生命活动的最基本要素

?一套基因组；一层细胞膜；一套完整的代谢系统。

第二节 原核细胞与真核细胞 1、细胞分类

?传统分类法根据生物的营养方式，运动能力和细胞结构的特点，把一切生物划分为动物界和植物界两大界。植物细胞的主要特征是具有硬的细胞壁和进行光合作用的叶绿体。细菌和真菌虽无叶绿体，但却都具有细胞壁，所以过去一直把它列入植物界

?1925年Chatton 把细胞中不含有由膜包围的细胞核的

生物称为原核生物。例如细菌，蓝细菌。自从原核生物概念提出以后，则把含有由被膜包围的核的细胞称为真核生物

?20世纪60年代H. Ris提出了原核细胞和真核细胞的概

念

?现代分类系统将生物划分为真核生物和原核生物

–由原核细胞构成的生物—— 原核生物；由真核细胞构成

的生物—— 真核生物

2.原核细胞与真核细胞的区别 1）结构上的主要差异

２）遗传装置及基因表达调控方式的差异 遗传装置：

原核细胞ＤＮＡ：环状，一个，裸露或结合少量蛋白质

? 真核细胞ＤＮＡ：线状，多个，与多种蛋白质结合 ? 真核细胞：ＤＮＡ＋组蛋白 ? 核小体 ? 染色质 ?

染色体

基因表达调控：

? 原核细胞：DNA没有 ―无用‖ 序列，均为编码序列；

基因主要以操纵子方式表达；转录和翻译同时同地进行

? 真核细胞：DNA常有 ―无用‖ 序列；基因常由多个内

含子和外显子相间排列组成；基因的转录产物要经过复杂的修饰加工；细胞核内转录，细胞质内翻译 3、 原核细胞（procaryotic cell） 主要特征

拟核：没有由膜包围的细胞核。遗传物质集中在一个没有明确界限的低电子密度区域中，此区域称为拟核 –细胞膜:具有单位膜的典型特征，厚约为10nm;某些原核