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3-2培养密度

原代培养的细胞接种密度可能对成功培养有影响，于海微等（2009）试验了5×108 L-1、 1×109 L-1、 5×109 L-1、 1×1010 L-1的接种密度，发现以5×108 L-1密度接种时细胞一直无法传代，以5×109 L-1的密度接种时细胞贴壁时间、出现伸展时间及原代培养时间均显著短于其他接种密度。 文献中报道的接种密度： 2.2×108 L-1 1.5×109 L-1 1×106/cm2 1×108 L-1

3×106/皿， 接种若干?100 mm细胞培养皿 3-3培养条件

37 ℃、饱和湿度、体积分数为5% CO2孵育箱内培养 3-4换液

细胞生长消耗培养基的养分，同时产生代谢废物，限制细胞生长，所以需要及时换液，但是换液太频繁会造成浪费，此外可以胎盘间充质干细胞呈贴壁生长，可以利用此特性在换液时与其他杂细胞进一步分离，但在培养早期，胎盘间充质干细胞贴壁不牢固，第一次换液时间过早将损失获取的胎盘间充质干细胞。故需要通过实时观察并根据实际情况探究合适的原代培养的第一次换液时间和后续培养的换液频率。文献中报道的首次换液时间有2d，3d，7d全量或半量换液，弃去未贴壁细胞，以后每三四天换液1次。 文献中报道的换液时间和方式： 每3 d全量换液1次

培养48 h后半量换液，去除未贴壁细胞，以后每三四天换液1次 7 d后首次全量换液，弃去未贴壁细胞，每三四天换液1次 3 d后半量换液，1周后再次换液，此后每隔3 d换液1次

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5~7 d后全量换液，以后每3 d换液 3d全量换液，以后每周换液2次 3d后半量换液，继续培养2d后全量换液 2d换液，以后每3 d换液1次 3-5 传代培养

待原代培养的细胞贴壁连生面积达70%~90%后（贴壁细胞生长至 70% -90%融合时），用胰酶消化（2.5 g/L胰酶或0.25%胰酶或1.25 g/L胰蛋白酶-1 g/L乙二胺四乙酸），按1：2或1：3或1∶4的比例传代，或以（2.5~5.0）×103/cm2密度接种传代培养。（消化时间？去除培养基后加酶消化？胰蛋白酶用PBS还是培养基溶解？每个培养瓶用多少量的酶消化？） 3-6细胞形态与生长速度 3-7 MSC的冻存与复苏：

冻存液中DMSO的浓度可能对细胞活力产生影响，丛珊等（2015）对此进行过实验，将 3 组不同冻存液冻存的 hAMSCs 冻存 48 h后进行复苏培养。冷冻保护液一： 5% 二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)＋50% 标准胎牛血清+45% DMEM/F12。冷冻保护液二：10% DMSO＋50% 标准胎牛血清+40% DMEM/F12。冷冻保护液三：20% DMSO＋50% 标准胎牛血清+30% DMEM/F12。 结果显示， DMSO浓度为5%时，细胞在 2 h后开始贴壁， 4 h时几乎全部细胞贴壁；DMSO浓度为10%和20%的两组活力较差，细胞仍是圆形，且无贴壁现象。

复苏培养：解冻时从液氮罐中取出冷冻管，将其放入37 ℃水浴锅迅速融化约1~2 min（或放入37℃、5% CO2、 饱和湿度的培养箱中使其融化）。将冻存管中液体加入有培养基的离心管中，1500 r/min 离心5 min，去掉上清，接种到新的培养基皿中，于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，第2天更换培养液（丛珊等，2015）。

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4细胞表面抗原检测

由于培养细胞的形状不能作为鉴别细胞类型的主要特征标志，因此，通常都采用流式细胞术对细胞表面抗原分子进行鉴定。不同的研究人员观察到 MSC 表达不同的表面标记，造成这种情况的原因有很多， 包括MSC的来源、 供者的年龄、提取的方法和扩增的条件等都会影响MSC 的表面标记（韩之波等，2012）。国际上对于 MSC 的鉴定仍具争议，目前认可度较高的 ISCT（国际细胞治疗协会）间充质干细胞委员会制定的一系列标准。流式细胞仪分析鉴定MSC应细胞表达黏附分子和基质细胞标记 CD73、 CD90、 CD105， 整合蛋白家族CD29，以及透明质酸盐受体 CD44，不表达造血细胞标记 CD11b、 CD34、 CD45 和 HLA-DR。

5生长曲线

6细胞周期

7分化潜能

参考文献

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附件1不同实验室从脐带血，脐带和胎盘等各组织中分离MSC的方法

脐带血

分娩后穿刺脐静脉抽取50 mL 脐带血液，4℃冰箱保存，12 h 内分离，用Hank’s 平衡液稀释脐带血，稀释血液缓慢叠加于Ficoll上，离心，吸出乳白色云雾状单个核细胞，洗涤离心2 次，将获得的单个核细胞分别以5×108/L密度种植入25 cm2的塑料培养瓶中，加入完全培养基吹打，混匀。置于37℃、含体积分数为0.05 的CO2饱和湿度培养箱中，5~7 d后全量换液，以后每3 d换液，并逐日观察细胞贴壁延伸时间、原代培养时间及细胞生长情况（于海微等，2009）。

距胎儿5-7cm的脐带处进行双结扎，剪断脐带，消毒母侧脐带断端，穿刺脐静脉抽取脐血40-120mL，加肝素抗凝，4h内分离（管英华等，2011）。淋巴细胞分离液法: 将脐带血与无血清DMEM/F12培养基1:1体积比混合，缓慢加至含有等体积的Ficoll ( 密度为1.077g/L ) 分离液上，1800r/min离心20min，取中间白膜层，经培养基以1000r/min离心10min洗涤2次，细胞接种密度为5*107接种至25cm2培养瓶中，置于37℃，5%的CO2饱和湿度孵箱中培养，细胞融合达到80%时，0.25%胰蛋白酶消化传代（管英华等，2011）。羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法: 将脐带血与6%羟乙基淀粉按4:1的体积比混合，常温下静置30-45min，取上清液，1000r/min离心10min，弃去上清，培养基重悬细胞将其缓慢加至含有等体积的Ficoll ( 密度1.077g/L )分离液上（管英华等，2011）。 脐带

将无菌条件下取得的足月妊娠分娩胎儿脐带，用PBS洗3 次，去掉残留的血细胞。把脐带剪切成2.0 cm左右的片段并剔除血管（1 条脐静脉，2条脐动脉），取出其中的凝胶状组织，将其剪成大小约1 mm3的组织块，然后置于培养瓶中。6 h后，加入含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养基，放置在37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。3 d 后

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