PFAFFL Method for real timePCR 下载本文

内容发布更新时间 : 2024/12/23 17:33:18星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

PFAFFL Method for real time PCR

简介:

荧光定量PCR方法:用于相对定量。 适用条件:目标基因与内标基因扩增效率相差较大,特别适用于国内习惯于将内标与目标分开扩增。

优点:不需要标准曲线,结果比delta-delta-Ct法更加精确。

缺点:需要知道在Ct值处的扩增效率,好在OM3已经可以提供该值。

数学推导:

M01:处理1目标基因初始拷贝数 Mn1:处理1目标基因n次循环后拷贝数 M02:处理2目标基因初始拷贝数 Mn2:处理2目标基因n次循环后拷贝数 N01:处理1内标基因初始拷贝数 Nn1:处理1目标基因n次循环后拷贝数 N02:处理2内标基因初始拷贝数 Nn2:处理1目标基因n次循环后拷贝数 EM:目标基因扩增效率 EN:内标基因扩增效率

CtM2:处理2目标基因的Ct值 CtM1:处理1目标基因的Ct值 CtN2:处理2内标基因的Ct值 CtM1:处理1内标基因的Ct值

目标基因扩增结果: Mn2=M02(1+ EM)n Mn1=M01(1+ EM)n

将Ct带入:

Mct2=M02(1+ EM)CtM2=A(域值) Mct1=M01(1+ EM) CtM1=A(域值)

两式相除得:

M02/M01=(1+ EM) CtM2CtM1 1

同理得:

N02/N01=(1+ EN) CtN2CtN1 2

两个处理的目标基因相对表达量为:(利用1式和2式)

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(M02/N02) :(M01/N01)=(1+ EM) CtM2CtM1/(1+ EN) CtN2CtN1