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华南师范大学实验报告

学生姓名 闫红博 学 号 20122501108 专 业 生物科学 年级、班级 12级生科三班 课程名称 分子生物学实验

实验项目：质粒DNA酶切、连接、电泳检测

实验类型 □验证□设计□综合 实验时间 2015年4月21日 实验指导老师 实验评分

一、实验目的

1、掌握限制性内切酶的特性及酶切体系的建立； 2、了解影响酶切的因素；

3、掌握DNA连接酶的性质以及连接体系的建立； 4、了解影响连接反应的因素。 二、实验原理

1、限制性内切酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。 2、限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。 3、DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。4、 常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶。二者的作用机理类似。

三、实验试剂和材料 1、材料与试剂 酶切反应：

标准pUC19(2686bp)

EcoRⅠ及其配套的酶切缓冲液 检测：

0.5×TBE电泳缓冲液

6×电泳载样缓冲液 、Goldview、琼脂糖 四、实验步骤 （一）质粒DNA酶切

在200μl 的薄壁离心管中，按照下表加入试剂（单位：μl） ↓

混匀；点动离心将反应液甩至管底。37℃(PCR仪)保温1-2h进行酶切反应。 ↓

反应结束后， 75℃，保温10min使酶失活。 ↓ 电泳检测 样品代号

无菌水(μl)

P H

质粒(μl) 酶切缓冲液(μl)

E

EcoRI(μl)

Total(μ 10

酶

1.0 6 1 2

成份

反应1（标准pUC19)

（二）质粒DNA的连接

取200 μl的离心管按下表加入试剂。 ↓

混匀后点动离心，将溶液甩至管底

↓

置于已调好温度为12℃-14℃PCR仪中 ↓

保温1-2h后取出 ↓ 电泳检测 样品代号 I

ddH2O

λDNA/EcoT14 I片段

7.0 10.0

成分

用量（μl）

f T

连接缓冲液 T4DNA连接酶 总体积

2.0 1.0 20

五、实验结果

质粒DNA酶切实验结果图

结果分析：从左向右，我的是第六条带，没有出现扩散情况。说明没有蛋白质与DNA结合，酶切条件也比较合适，没有外切核酸酶污染。