绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达 下载本文

内容发布更新时间 : 2024/12/25 15:59:37星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达

背景知识

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时,GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成,长2.6kb;GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr,其蛋白性质十分稳定,能耐受60℃处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构,长420 nm,宽240 nm,由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成,荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.

1996 年GFP 的晶体结构被解出,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构,长420 nm,宽240 nm,由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成,荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。

实验一 质粒DNA的分离与纯化

一、实验目的

掌握一种最常用的质粒DNA提取方法:碱裂解法。该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA,比较方便、省时,提取的质粒DNA质量较高,可用于DNA的酶切、PCR甚至测序。 二、基本原理

质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外,能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止,从细菌中分离得到的质粒都是环型双链DNA分子,分子量范围从1kb到200kb。质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态,但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制,因此每个细胞中只含一个或几个拷贝,称为严谨型质粒,有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严,称为松弛型质粒,它们在每个细胞中的数目可达10-200个拷贝。当宿主细胞的蛋白质合成受到抑制时(例如经氯霉素处理),细菌染色体虽不再增加,但松弛型质粒DNA可继续被复制,以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。

质粒具有一定的生物功能,它们往往带有一些抗药标记,当质粒DNA用人为的方法转化进细菌时,转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型,例如,把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后,原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特征,可证实质粒已转入宿主细菌中,这样就可以作为转化菌的选择性标记。

质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取,它们都包括三个基本的步骤:细菌的生长和质粒的扩增;菌体的收集裂解,质粒DNA的分离;质粒DNA的纯化。

1、 细菌的生长和质粒的扩增

从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落,接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于松弛型质粒(如pUC系列)来说,只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期,