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临床医学检验技师考试辅导 《临床检验基础》

新载玻片常带有游离碱质，必须以1mol／L HCl浸泡，清洗。载玻片应清洁、干燥、中性、无油腻。

二、血涂片的制备

1.手工推片法：影响涂片厚薄的因素有：血滴大小、推片与载玻片间夹角（25°-30°）、推片速度、血细胞比容。一张良好的血片，应厚薄适宜、头体尾明显、细胞分布均匀、血膜边缘整齐、并留有一定空隙。 2.载玻片压拉法：适用于血细胞活体染色。

3.棕黄层涂片法：适用于白细胞减低患者的白细胞分类计数、红斑狼疮细胞检查等。

图1 血涂片制备

一般良好的涂片是：厚薄适宜，头体尾分明，细胞分布均匀，边缘整齐，两边和两端留有空隙各0.3cm和0.5cm，血膜占血片的2/3。

第五节 细胞染色

本节考点： （1）瑞氏染色法 （2）吉姆萨染色法

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血涂片在用光学显微镜观察前需要固定和染色。固定是将细胞蛋白质和多糖等成分迅速交联凝固，以保持细胞原有形态结构不发生变化。染色是使细胞的主要结构，如细胞膜、细胞质、细胞核等染上不同的颜色，以便于镜下观察识别。

血涂片染色方法大多源自罗氏染色法，常用瑞氏染色法、姬姆萨染色法。

一、瑞氏染色法 1.瑞氏染料

由酸性染料伊红（E-）和碱性染料亚甲蓝（M+）组成。伊红通常为钠盐，有色部分为阴离子。亚甲蓝（又名美蓝）为四甲基硫堇染料，有对醌型和邻醌型两种结构。通常为氯盐，即氯化美蓝，有色部分为阳离子。美蓝容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料（即天青）。将适量伊红、美蓝溶解在甲醇中，即为瑞氏染料。甲醇的作用：一是溶解美蓝和伊红；二是固定细胞形态。 2.染色原理

既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用。各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样。如血红蛋白、嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合，染粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞胞质为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色或蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫红色，称为嗜中性物质、原始红细胞、早幼红细胞胞质、核仁含较多酸性物质，染成较浓厚的蓝色；中幼红细胞既含酸性物质，又含碱性物质，染成红蓝色或灰红色；完全成熟红细胞，酸性物质彻底消失后，染成粉红色。 3.pH的影响 （pH6.4～pH6.8）

细胞各种成分均属蛋白质，因蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液pH而定，在偏酸性环境中正电荷增多，易与伊红结合，红细胞和嗜酸性粒细胞染色偏红，细胞核呈淡蓝色或不染色；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝结合，所有细胞呈灰蓝色，颗粒呈深暗，嗜酸性颗粒呈暗褐，甚至棕黑色，中性颗粒偏粗，呈紫黑色。稀释染液必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致细胞染色呈色异常，形态难以识别，甚至错误。

4.染色方法和注意事项

（1）血涂片干透后固定，否则细胞在染色过程中容易脱落。 （2）冲洗时应以流水冲洗，不能先倒掉染液，以防染料沉着在血涂片上。冲洗时间不能过久，以防脱色。如血涂片上有染料颗粒沉积，可滴加甲醇，然后立即用流水冲洗。 （3）染色过淡可以复染，复染时应先加缓冲液，然后加染液。染色过深可用流水冲洗或浸泡，也可用甲醇脱色。

（4）瑞氏染色Ⅰ液由瑞氏染料、甲醇（AR级以上）和甘油组成，Ⅱ液为磷酸盐缓冲液（pH6.4～pH6.8）。

二、姬姆萨染色法 1.染色原理

姬姆萨染液由天青、伊红组成。染色原理和结果与瑞氏染色基本相同。 2.染色方法和注意事项 ①需先用甲醇固定3～5分钟。 ②姬姆萨染液由姬姆萨染料、甘油和甲醇组成。染色前，用磷酸盐缓冲液（pH6.4～pH6.8）稀释姬姆萨染液10～20倍。

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第六节 方法学评价

本节考点： （1）血涂片制备 （2）血液细胞染色

一、血涂片制备

手工推片法用血量少、操作简单，是应用最广泛的方法。棕黄层涂片法可提高异常情况的阳性检出率。此外，疟原虫、微丝蚴等检查可采用厚血涂片法。离心涂片法，可获得分布均匀、形态完好的细胞涂片。

二、血液细胞染色

瑞氏染色法是最经典、最常用染色法，尤其对于细胞质成分、中性颗粒等可获得很好的染色效果，但对细胞核的着色能力略差。姬姆萨染液对细胞核、寄生虫（如疟原虫等）着色较好，结构更清晰，但对细胞质成分的着色能力略差。采用瑞氏-姬姆萨复合染液可使细胞胞质、颗粒、胞核等均获得满意的染色效果。 瑞氏染料的质量规格用吸光度比值（rA）来评价，rA测定方法：取瑞氏染液15～25μl，加甲醇10ml稀释，混匀，以甲醇为空白管，分别在波长650nm（美蓝吸收峰波长）、525nm（伊红吸收峰波长）测定吸光度（rA=A650／A525）。新配制染料rA接近2，随美蓝逐渐氧化为天青B（其吸收峰为650nm，吸光度约为美蓝一半），rA也下降，降到1.3±0.1时，染料即可使用。新鲜配制的染料偏碱，须在室温或是37℃下贮存一定时间，待美蓝逐渐变为天青B，贮存时间愈久，染色效果愈好。在贮存过程中，必须加塞，以防甲醇挥发（如加甘油）和氧化成甲酸，所用甲醇须为AR级，若其中含过多丙酮，会使染色偏酸，白细胞着色不良。

第七节 质量控制

本节考点： （1）血涂片制备 （2）血液细胞染色

一、血涂片制备

制备涂片时，血滴愈大、角度愈大、推片速度愈快，血膜愈厚，反之则愈薄。血细胞比容增高、血液粘度较高时，应采用小血滴、小角度、慢推，可得满意结果；血细胞比容减低、血液较稀时，应采用大血滴、大角度、快推。

二、血液细胞染色

染色过深、过浅与血涂片中细胞数量、血膜厚度、染色时间、染液浓度、pH密切相关。过深纠正方法是缩短染色时间、稀释染液、调节pH，过浅纠正方法是延长染色时间、调节pH。

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