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山西****药业有限公司 文件编码：J-ZJ-0001 共 10 页第 1 页

文件名称 文件编码 制 订 人 制订日期 颁发部门 分发部门 质量部 变更记录 高效液相色谱法操作规程 版 本 号 审 核 人 审核日期 GMP办公室 01 批 准 人 批准日期 实施日期 变更原因及目的：1.中国药典版本的更新；2.生产能力的扩容；3.为了更好的执行《药品生产质量管理规范》。 目的：制订高效液相色谱法操作规程，明确其检查法的操作。 依据：《中华人民共和国药典》2010年版；

《中国药品检验标准操作规范》2010年版。 范围：高效液相色谱法的操作。 责任：质检室主任、化验员。 内容：

高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。

1对仪器的一般要求

所用的仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。

1.1色谱柱 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。正向色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。

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填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合集团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。孔径在15nm（1nm=10?）以下的填料适于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。

除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在3～10μm之间。粒径更小（约2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。

使用微径柱时，输油泵的性能、进样体检、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。

以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60℃。

流动相的pH值应控制在2～8之间。当pH值大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时，应选用碱性的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面积覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH值小于2的流动相时，应选用碱性填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基键合硅胶填充剂，或有机-无机杂化填充剂等。

1.2 检测器 最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。

紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用性检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物质的吸收光谱，故可用于待测物的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。

紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待测溶液的浓度在一

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定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与待测溶液的浓度通常呈指数关系，故进行计算时，一般需经对数转换。

不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（《中国药典》2010年版二部附录Ⅳ A）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发性盐组分的流动相。

1.3流动相 反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统（采用紫外末端波长检测时，首选乙腈-水系统），如经试用不合适时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液的流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。

各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应供试品并达到系统适用性试验的要求。其中，调整流动相组分比例时，以组分比例较低者（小于或等于50%）相对改变量不超过±30%且绝对改变量不超过±10%为限，如30%相对改变量的数值超过10%时，则改变量以±10%为限。

对于必须使用的特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种，可在该品种项下注明。

2系统适用性试验

色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数。其中，分离度和重复性尤为重要。

按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，应符合要求。

2.1色谱柱的理论板数（n） 用于评价色谱柱的效能。由于不同物质在