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植物激素检测技术 --科标检测
植物激素是植物体内合成的一系列痕量有机化合物，它在植物的某一部位产生，运输到另一个或一些部位，在极低的浓度下便可引发生理反应，几乎参与了调控植物从种子休眠、萌发、营养、生长和分化到生殖、成熟和衰老的每个生命过程，既可调控植物自身的生长发育，又通过与植物所生存的外部环境互相作用调节其对环境的适应。通过调控如细胞分裂素、油菜素内酯和生长素等植物激素的代谢可显著地改良作物的株型结构和产量构成，从而大幅度提高作物产量和品质。
青岛科标检测研究院--生物实验室，拥有先进的仪器设备和丰富检测经验，根据国内外先进技术，可以根据不同样品不同检测需求，值得最优检测方案为企业和研究机构提供精确、公正的数据支持。
1 植物激素主要包括生长素(auxin)、赤霉素(gibberellin，GA)、细胞分裂素(cytokinin，CTK)、脱落酸(abscisic acid，ABA)、油菜素甾醇类(brassinosteroids，BRs)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)及其甲酯(MeJA)、水杨酸类(salicylic acids，SA)、乙烯(ethylene)和多肽激素(peptide hormones)等，它们在植物体内的含量极低(通常在ng/g，甚至pg/g水平上)，且周围共存的基体成分非常复杂，几乎不可能同时分析所有植物激素。此外，多数植物激素的性质不稳定，对温度等外界条件敏感，在各器官中呈现定的动态分布。因此精确可靠地对超微量的植物激素进行定性和定量分析尤为重要。
本文仅就近年来国内外在茉莉酸及其甲酯、脱落酸、生长素、赤霉素和多肽激素等植物激素分析检测技术的最新发展及应用情况进行综述。 2 主要分析技术
生物鉴定法是一类经典的植物激素检测方法，它利用激素作用于植物的组织或器官时产生的特异性反应对植物激素进行测定。1928年，Went首先将这种方法运用于生长素的测定，利用生长素能使燕麦胚芽鞘弯曲的特性来测定生长素浓度。生物鉴定法虽然简便，但对样品纯度要求较高，需要复杂的样品前处理过程来实现，同时由于其专一性和重复性较差，因而这种方法的应用逐渐减少。
免疫检测技术是测定植物激素的常用方法。该方法是基于抗原和抗体的特异性结合，因此有较好的专一性。采用放射性元素标记的方法，即放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)，其检测灵敏度高，重复性好，但对实验条件的要求较高。酶联免疫吸附分析(enzyme-1inked immunosorbent assay，ELISA)是一种简单易行并被广泛应用的分析检测技术，其原理主要是将抗原或抗体固定在载体表面，再与酶标记的抗体或抗原进行结合，洗涤除去未结合的部分后进行检测。Maldiney等在ELISA中引入抗生物素蛋白-生物素复合物体系，测定了生长素、脱落酸和玉米素核苷三种激素，检测限能够达到3～5pg。此外，免疫传感器也开始用于植物激素的测定，主要利用抗原和抗体间的相互作用进行识别，当被分析物(抗原)与抗体结合后，检测信号利用转换器转换为电信号，从而进行定量检测。免疫检测的方法一来容易受到交叉反应的干扰；二来由于抗体的不通用性以及制备时间较长，使得整个实验周期较长。 近年来，色谱技术的飞速发展使其在植物激素检测中的应用越米越广泛，主要利用各组分在色谱固定相上保留性质的差异实现分离，并根据色谱图中得出样品含量及纯度信息。气相色谱火焰离子化检测法(GC-FID)和气相色谱质谱法(GC-MS)能够对所分析样品进行准确、高灵敏度测量，但由于气相色谱对样品的特殊要求，使得待测组分需具有一定挥发性，因此在植物激素样品的前处理过程中需对样品进行衍生化。高效液相色谱紫外检测法(HPLC-UV)、高效液相色谱荧光检测法(HPLC-FL)和高效液相色谱质谱检测法(HPLC-MS)也大量用于植物激
素的纯化及定量分析，其中MS因为具有良好的选择性和灵敏度，并且能够给出化合物的结构信息，在实际检测中得到了更普遍的运用。以MS作检测器时，常采用稳定同位素标记的化合物作为内标，这样既扣除了萃取步骤中样品损失的影响，同时也能排除背景基质干扰，因此使得定量分析结果更为准确。此外，毛细管电泳技术(CE)的样品消耗量少、分离效果好，因而也是分离检测植物激素的有效手段，但由于灵敏度和重现性等方面的限制阻碍了其进一步的运用。 另外，目前还有一些其他的分析方法也被用于植物激素的检测，如光谱法、电化学法等。本文主要介绍以色谱法为主的植物激素分析检测技术的研究进展。 3 各类植物激素检测技术现状 3.1 茉莉酸及其甲酯
茉莉酸(JA)是十二碳的环戊烷酮酸，具有多种生物功能，可作为植物在应对外界伤害时产生的抵御信号，如植物在受到昆虫取食或非生物胁迫等伤害时，植株内茉莉酸含量就会增多。Zadra等测定了番茄在经臭氧刺激后，其茉莉酸含量的变化情况。实验中首先将茉莉酸衍生为具有一定挥发性的茉莉酸甲酯，然后采用顶空固相微萃取(HS-SPME)-GC-FID/MS进行检测，发现在停止臭氧熏蒸后9h，番茄叶中检测到的荣莉酸的量最高，增加了13倍。该方法快速简单，消耗的植物原料少，灵敏度高，检测限可达2ng/g，对正常植物产生的茉莉酸甲酯含量也可利用此方法进行测定。
Matsuura等建立了利用UPLC-MS/MS MRM(multiple reaction monitoring)方式同时测定植物内源的茉莉酸、水杨酸及其相关化合物的方法。采用氘代化合物作为内标进行定量，无需对目标化合物进行其他修饰，尤其对相关化合物如水杨酸葡萄糖苷(salicylic acid glucoside，SAG)和块茎酸葡萄糖苷(tuberonic acid glucoside，TAG)等的直接测定，与传统的分析方法相比大大节省了分析时间。由于SAG、TAG等化合物在植物体内的累积会对茉莉酸和水杨酸含量有一定影响，通过测定这些相关化合物的含量能够给出更多关于茉莉酸和水杨酸的信息，因此对其进行同时测定也具有重要的意义。
此外，CE技术也被用于茉莉酸的分析检测。Zhang等利用5-溴甲基荧光素(5-bromomethylfluorescein，5-BMF)作为荧光衍生剂，通过柱前衍生的方式标记茉莉酸，采用CZE-LIF分析模式，检测了橡胶树皮提取物中的茉莉酸含量，并研究了外加损伤情况下和正常生长树皮中荣莉酸含量的变化。实验结果表明受到损伤的样品中茉莉酸含量比正常生长样品中高近5倍，这一结果与茉莉酸的生物功能是一致的。该方法的衍生检测限为 5x10-7 mol/L，柱上检测灵敏度为2nmol/L。
Flores等将在线RPLC-GC联用技术应用于茉莉酸甲酯的分析检测中。LC-GC的主要优点在于能够将含有分析对象的样品馏分从全部转移至GC，而不需要借助其他离线手段从复杂基质里分离目标化合物，简化了样品制备过程，同时避免了样品损失，提高了检测灵敏度。LC-GC间采用炉转移吸附-解吸接口(through oven transfer adsorption杁esorption,TOTAD)，能够实现从LC到GC间组分转移、去溶剂化等过程的在线自动化操作。该方法能够方便、快速地对商品化的茉莉香精中茉莉酸甲酯进行检测，检测限可达0.01mg/L。
Ruiz del Castillo和Blanch用固相微萃取(SFME)-GC-MS联用技术分离检测茉莉酸甲酯的两种异构体：（一）-(3R，7R)和(+)-(3S，7S)-，并对五种茉莉属植物叶、三种迷迭香叶和多种商品化的茉莉、迷迭香香料样品进行了分析比较。发现在茉莉属植物中存在一定范围的对映体过量(13%～95%)，而在所有迷迭香样品中只存在纯的（一）-茉莉酸甲酯异构体。另外，在香料样品中不同的对映体过量情况能够反映出生产工艺中是否有外添加的情况。
Blanch等利用HPLC分离了茉莉酸甲酯的四种手性异构体，实验采用全甲基化的β环糊精手性柱(Nucleodex- β-PM column)，当流动相甲醇(含0.l%乙酸三乙铵)和水的比例为55:45时，四种异构体能够得到较好的分离。该方法无需其他柱前衍生步骤即可直接借助HPLC对
四种化合物进行分离检测，方便快捷，通过组分收集可以得到纯的(-)-和(+)-茉莉酸甲酯，提供了一种制备光学纯茉莉酸甲酯的简单方法。 3.2 脱落酸
脱落酸(ABA)是一类单环倍半萜化合物，能够调节植物种子萌发、气孔闭合等生理过程，并且与许多胁迫诱导的基因控制表达有关，从而调节植物适应干旱、盐度、寒冷等环境胁迫。因此，通过考查植物体内ABA的浓度变化可获得关于ABA生物合成和降解路径的信息，以及各种生理条件、外界环境变化等因素对植物的影响。
Vilar6等用LC-ESI-MS在选择离子检测（selected ion monitoring，SIM)模式下测定了不同灌溉情况下葡萄叶中的ABA含量，采用氘代ABA作为内标，检测限可达0.2nmol/g(以干重计)。L?ez-Carbonell等运用LC-ESI-MS/MS MRM的方法测定了微白岩蔷薇中脱落酸(MBA)及其主要的葡萄糖偶联物-脱落酸葡萄糖酯(ABA-GE)浓度。该方法在萃取样品前加入一定量的氘代内标化合物，经过简单的萃取、离心等处理，样品便可用于LC分析，得到的色谱图简单，易于分析，其中ABA的检测限可达1.4ng/g(以湿重计)。该方法分析了地中海气候条件下生长的微白岩蔷薇一年内其ABA 于ABA-GE的含量变化，结果表明内源ABA的合成至少在一定程度上是同ABA-GE的分解有关联的。
免疫亲和色谱技术也被用于脱落酸的高灵敏检测。Hradecká等制备了对Cl固定的(+)-顺，反脱落酸有较高选择性的多克隆抗体，将其做成免疫亲和凝胶柱，与LC-ESI-Ms结合用于烟草叶中的ABA分析。免疫亲和柱的优势在于能够快速纯化、富集样品，由于其较高的选择性，大大降低了复杂基质的影响，简化了被分析样品的成分，使得经LC分析得到的谱图更简单、更易辨认，灵敏度提高了十几倍。实验中通过对缺水烟草和正常生长的烟草的对比分析，发现在缺水条件下内源的ABA含量是正常情况的5～7倍，其值在缺水24 h时达到极值，这一结果与ABA能够调节干旱胁迫的生物功能是相一致的。
此外，CE也用于对ABA的分析测定。Liu等发展了CE-LIF测定烟草叶中ABA的方法。实验采用8-氨基芘-1，3，6-三磺酸盐(APTS)作为荧光衍生剂，在乙酸和氰基硼氧化钠存在条件下，与ABA的羰基反应形成具有荧光的APTS-ABA衍生物，用毛细管区带电泳(CZE)-LIF进行分析检测。该方法样品处理过程简单，衍生检测限为2.8×10-8mol/L，柱上检测灵敏度可达l.1nmol/L，足够用于检测实际植物内的痕量ABA。 3.3 生长素
生长素是最先被发现的一类植物激素，主要由吲哚衍生物构成，是主要的植物生长调节因子，能够调节细胞的分裂、伸长和分化。
Lu等利用LC-ESI-离子阱质谱(TTMS)同时测定了四种生长素：内源性的吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸（IBA)和外源性的吲哚-3-丙酸(IPA)、l-萘乙酸(NAA)。该四种化合物在7 min内出峰并实现基线分离，方法的检测限达8.0ng/mL。Rolèík等利用固相萃取(SPE)技术提取和纯化植物叶中IAA，并优化了相关的实验条件。实验过程中分两步使用C18-SPE柱，第一步将粗提溶液过柱除去叶绿素和其他残渣，然后在稀释的洗脱液中加入甲酸使IAA质子化成中性结构，中性的IAA再次经C18柱保留、甲醇洗脱后进行分析。用氚标记的IAA作标准溶液，闪烁计数测量IAA在不同洗脱强度下的保留情况，从而优化洗脱液成分。纯化后的样品再经中基化衍生后用GC-MS测定IAA含量。采用该方法测定了天竺葵属植物叶中的IAA，其含量为84 ng/g(以湿重计)。
Dobrev等发展了二维液相技术分离测定生长素的方法。经过SPE处理后的样品进入第一维进行初步分离后，采用\中心切割(heart cutting)\的方法，将第一维的部分组分引入第二维进行再次分离，使分离纯化效果明显提高，即使不采用质谱检测的选择离子检测模式，而利用选择检测性不高的紫外或荧光检测器时，得到的分离效果依然令人满意，用荧光检测器对IAA的检测限可达0.4 pmol。