内容发布更新时间 : 2024/11/16 11:53:30星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

海洋微生物抗生素的开发方案

摘要：海洋微生物种类约为陆生微生物的20倍以上。海洋微生物由于其高盐、高压、低温、

低光照和寡营养的特殊的生存环境，从而可合成一些结构新颖的陆生微生物所不具备的抗生素。高质量的海洋微生物菌种库及其天然产物库是新药开发的重要来源。开发海洋微生物资源并从中筛选出有效的新抗生素具有重要的意义。【1】本文中将介绍筛选抗生素的国内外研究进展，并详细介绍海洋微生物进行菌株鉴定、抗生素的筛选分离提取，活性成分化学显色的初步研究的实验方法及所涉及的相关技术。

关键词：海洋微生物，抗生素，筛选，提取分离纯化，结构鉴定

1.立题背景

1.1 海洋微生物抗生素研发意义: 海洋微生物抗生素的研究源于二十世纪上半叶对陆生微生物资源开发的巨大成就。自从1929年发现青霉素以来，迄今已有超过120种的陆生微生物的次生代谢产物用作临床上的抗生素药物。抗生素(Antibiotics)最初是指由微生物产生，具有相对选择毒性，在极低浓度下能抑制病原微生物(或癌细胞)生长繁殖的物质。众所周知，半个世纪以来，陆栖微生物早已成为抗生素、酶抑制剂等生物活性物质的重要资源，一度形成了辉煌的抗生素时代。随着抗生素的广泛应用，在临床上引起两个问题：一是细菌耐药性逐年增加，致使一些抗生素的疗效降低，甚至无效；另一问题是一些不致病的细菌成为条件致病菌，在临床上造成一定的威胁。因而需要不断筛选新结构和新的抗菌作用机制的新抗生素以满足临床需要。然而对陆生微生物的长期研究已使得陆地这一古老资源日趋枯竭，因此，拓宽寻找新药的途径迫在眉睫。据研究发现，约27％的海洋微生物都能产生抗菌活性物质。已经成为筛选新型抗生素的重要来源。【2】

1.2 背景:从海洋微生物研究抗生素的历史可以追溯到19世纪末。1889年，De Giaxa发现海水对炭疽杆菌和霍乱弧菌的生长具有抑制作用，指出海洋微生物可能产生抑制细菌生长的物质”1966年Burkholder等从波多黎各海域分离到的食溴假单胞菌产生的含溴吡咯类抗生素硝吡咯菌素(Pyrolnitrin)”，标志着从海洋微生物分离抗生素物质的开始。【3】

1.3 现状:20世纪70年代中期，海洋微生物抗生素研究进入了加速发展期。东京大学微生物研究所率先开展了卓有成效的系统研究，在此后十几年间该研究所对海洋细菌，特别是海洋沉集物中的放线菌进行了深入的研究，奠定了海洋微生物抗生素研究的基础。美国加利佛尼亚大学Scripps海洋研究所Fenical教授领导的科研小组，对海洋微生物同样进行着长期不懈

的研究。从1988年开始，该小组先从虾卵表面以及一种丝状蓝藻表面的共生细菌入手，这些共生细菌明显具有分泌拮抗物质抵御病原体入侵共生体的作用。1989年报道从1000 m的深海中分离到一株嗜盐的革兰阳性菌，产生一系列新的细胞毒性和抗真菌的大环内酯A—F，作为主要的代谢产物，大环内酯A，还对单纯疱疹病毒和HIV病毒有抑制效果。目前Fenical研究小组共报道获得14种新的抗生素。美国的其它一些实验室，德国、法国、加拿大、西班牙等国的研究机构也都在开发新的海洋微生物抗生素，已发现了26种新抗生素。 1.4 国内外研究进展:

1.4.1 来源于海洋细菌和放线菌的抗生素。

Bell从硬磷鱼(Ostracion CUbicus)的毒液中分离纯化出副溶血弧菌，分离得到吲哚类衍生物Vibrindole A，对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌和枯草杆菌有一定的抑制活性。【4】Fenical研究组从链霉菌中得到4种稀有的吩嗪衍生物卜异鼠李糖酯类化合物，具有很强的广谱抗菌作用。【5】方金瑞等对海洋底栖菌进行活性筛选的过程中发现耐盐嗜碱放线菌2B，产生的抗菌物质2B-B经研究是氨基糖苷类的丁酰苷菌素。该研究开辟了氨基糖苷类抗生素化学结构修饰的新途径。【6】 1.4.2 来源于海洋真菌的抗生素。

Kobayashi研究组从琉球红藻门植物Ceratodictyon 体表分离到的真菌的发酵液中得到五环蕙环类衍生物Ser agaki none A。【7】Wi lkinson等从来自印度洋的曲霉菌的培养液分离到一种新型环缩二氨酸Gl i ot oxi n。Albaugh等报道从我国深圳潮间带红树上分离到一株海洋真菌Hypoxylon oceanicum LL-15G256。 1.5 海洋抗菌活性物质研究的难点及解决的方法

开发海洋药物则有许多因难，其关键在于药源难以解决。事实上，绝大多数海洋生物活性物质含量极微。这一特征表明，对大部分活性物质来说，直接利用海洋生物作原料进行分离提取，是很难满足需求的。今后一段时期内有关海洋微生物的生物活性物质的研究重点将主要集中在以下几个方面：(1)扩大筛选范围，寻找新的具有药用价值的微生物资源，并建立适合海洋生物活性物质的大规模筛选技术。(2)继续深入开展对海洋微生物的分离提取和培养方法的研究。(3)结合现代发酵工程技术，研究适合于海洋微生物的发酵工艺条件和修饰方法，加快利用海洋微生物生产海洋药物及保健品的工业化进程。(4)结合现代生物工程技术，提高海洋生物产物的质和量，重视可再生资源的研究与开发，保证海洋生物资源持续有效的被利用。

2.海洋微生物抗生素研究方案(提取精制流程）

本课题的基本思路是通过菌株筛选分离，抗生素活性筛选，通过高效液相色谱分析，薄层色谱分析及自显影技术来确定抗生素的分子组成。对已经构建的海洋微生物天然产物库进行质量评价，建立活性筛选模型，设计了引物，通过PCR 扩增的方法对海洋微生物库进行序列筛选。

2.1 海洋微生物抗生素的分离及纯化

2.1.1抗真菌活性的测定

采用琼脂块法。将分离到的海洋微生物涂布于海洋微生物分离培养基上，30 ℃培养5d，用无菌打孔器打下一块，分别轻贴于表面涂布有指示菌的指示培养基平板上，30℃培养1-2d，观察并测量抑菌圈直径。也可以采用纸片扩散法测定, 细菌测定培养基为肉膏琼脂( pH7. 0) , 37 度培养过夜; 真菌测定培养基为沙氏琼脂( 自然pH ) , 28 度培养约24~ 48h 后测量抑菌圈直径。

2．1.2 代谢产物的提取分离纯化

抗生素的分离纯化，目的在于从发酵液或培养液中分离纯化具有一定纯度的代谢产物。按常规的稀释涂平板法涂平板，30 ℃培养3-5 d，挑单菌落接种于对应的培养基斜面，30℃培养3-5d。抗生素的一般分离纯化方法为：

发酵液预处理固液分离

初步纯化（提取）高度纯化（精制）成品加工