内容发布更新时间 : 2024/9/29 6:40:20星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
Western blot 操作流程
1、取一生长状态良好的培养皿（10cm），胰酶消化传代，以1：4传代 2、培养24后换液（或第二天更换培养液）
3、观察细胞的生长状态，取在对数生长期细胞，占满70%-80%皿 4、用PBS洗涤一次后，更换新培养液
5、加入BBR预处理半小时后，加入H2O2致凋亡处理 6、共培养4小时后，用不含EDTA的胰酶消化收集细胞 7、PBS洗涤细胞2次（1200rpm，5-8min） 8、-80℃冰箱保存 皿号 1# 2# 3# 4# 5# 6# 10cm培养皿 200uM H2O2 皿号 1# 2# 3# 4# 5# 6# Y(终浓度) 0μM/L 0μM/L 1μM/L 5μM/L 10μM/L 20μM/L X（取液量） DMEM 0μL 0μL 20μL 100μL 200μL 400μL 10mL 9ml+938.7μL 9ml+918.7μL 9ml+838.7μL 9ml+738.7μL 9ml+538.7μL H2O2 0μL 61.3μL 61.3μL 61.3μL 61.3μL 61.3μL 需要抽取培养液 0μL 61.3μL 81.3μL 161.3μL 261.3μL 461.3μL 细胞组 正常细胞组 模型细胞组 药物治疗组 药物治疗组 药物治疗组 药物治疗组 处理方式 无任何药物情况下，细胞凋亡率 H2O2对细胞的致凋亡率 1μM/L BBR药物干预抗凋亡的作用 5μM/L BBR药物干预抗凋亡的作用 10μM/L BBR药物干预抗凋亡的作用 20μM/L BBR药物干预抗凋亡的作用 注：提前半小时加入BBR，之后加入H2O2作用4小时 附：BBR计算公式：
500μM/L*XμL=10μM/L*10000μL X=200μL
方式：10μL母液，溶于 ( 2 )mL PBS中 即得使用溶度BBR 500μM/L H2O2计算公式：200μM/L *10000μL=ρV/34*10-3 moL ρ=1.11g/ml V=68000/ρ*10-3 （μL） V’=68/ρ（μL）=61.3（μL） 方式：取10μL30%双氧水溶于10ml灭菌去离子纯水，稀释1000倍 10cm培养皿 400uM H2O2 皿号 1# 2# 3# 4# 5# 6#
Y(终浓度) 0μM/L 0μM/L 1μM/L 5μM/L 10μM/L 20μM/L X（取液量） DMEM 0μL 0μL 20μL 100μL 200μL 400μL 10mL 9ml+938.7μL 9ml+918.7μL 9ml+838.7μL 9ml+738.7μL 9ml+538.7μL H2O2 0μL 122.6μL 122.6μL 122.6μL 122.6μL 122.6μL 需要抽取培养液 0μL 122.6μL 142.6μL 222.6μL 322.6μL 522.6μL
BBR上调相关信号通路蛋白 BBR上调哪些信号通路蛋白磷酸化
（AKt/p-AKt、ERK/p-ERK、p38/p-p38、JNK/p-JNK）
1、选取对照组、1uM BBR、5uM BBR、10uM BBR、20uM BBR 2、制作6孔板培养细胞24~48小时
3、更换培养液后四小时，加入BBR共培养1小时
4、准备：碎冰、蛋白提取试剂盒、PBS、1.5ml EP管 5~8只、1ml EP管5~8只。
5、配置蛋白裂解液，每1ml+1uL+10uLPMSF+5uL配置，预冷离心机4度
6、在超净台操作，弃培养液，PBS洗涤三次
7、将培养皿置于冰上，每十分钟震荡一下，共计30分钟 8、用1ml的枪头吹打细胞呈悬液，收集至1.5ml EP管 9、置于预冷的离心机，离心：12000~14000转，5min 10、吸取上清液至1ml EP管，-80度保存
BBR上调相关信号通路蛋白 BBR上调哪些信号通路蛋白磷酸化 （caspase-3、Bcl、Bax、β-actin）
1、选取对照组、模型组、1uMBBR、5uM BBR、10uM BBR、20uM BBR 2、制作6孔板培养细胞24~48小时
3、更换培养液后四小时，加入BBR共培养1小时
4、准备：碎冰、蛋白提取试剂盒、PBS、1.5ml EP管 5~8只、1ml EP管5~8只。
5、配置蛋白裂解液，每1ml+1uL+10uLPMSF+5uL配置，预冷离心机4度
6、在超净台操作，弃培养液，PBS洗涤三次
7、将培养皿置于冰上，每十分钟震荡一下，共计30分钟 8、用1ml的枪头吹打细胞呈悬液，收集至1.5ml EP管 9、置于预冷的离心机，离心：12000~14000转，5min 10、吸取上清液至1ml EP管，-80度保存