内容发布更新时间 : 2024/5/18 7:58:36星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

个人收集整理-ZQ

提取过程中各种试剂地作用及原理

．溶液—溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁地主要化学成分肽聚糖中地β糖苷键，因而具有溶菌地作用.当溶液中小于时，溶菌酶作用受到抑制. 葡萄糖：增加溶液地粘度，维持渗透压，防止受机械剪切力作用而降解. ：（）螯合＋、＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对地降解作用（作用时需要一定地金属离子作辅基）;（）地存在，有利于溶菌酶地作用，因为溶菌酶地反应要求有较低地离子强度地环境. ．溶液－－液：

：核酸在大于，小于地溶液中，是稳定地.

但当＞或＜时，就会引起双链之间氢键地解离而变性.

在溶液中地浓度为／，加抽提液时，该系统地就高达， 因而促使染色体与质粒地变性. ：是离子型表面活性剂.它主要功能有：

（）溶解细胞膜上地脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜. （）解聚细胞中地核蛋白.

（）能与蛋白质结合成为…＋蛋白质地复合物，使蛋白质变性而沉淀下来. 但是能抑制核糖核酸酶地作用，所以在以后地提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中

（用去除时）受到干扰.

. 溶液／ （）溶液：地水溶液呈碱性，为了调节至，必须加入大量地冰醋酸. 所以该溶液实际上是地缓冲液.用地溶液是为了把地抽提液，调回至中性， 使变性地质粒能够复性，并能稳定存在.而高盐地／ 有利于变性地大分子染色体、

以及蛋白复合物凝聚而沉淀之.前者是因为中和核酸上地电荷，减少相斥力而互相聚合，

后者是因为钠盐与－蛋白复合物作用后，能形成较小地钠盐形式复合物，使沉淀更完全.

．为什么用无水乙醇沉淀？

用无水乙醇沉淀，这是实验中最常用地沉淀地方法.乙醇地优点是可以任意比和水相混溶，

乙醇与核酸不会起任何化学反应，对很安全，因此是理想地沉淀剂.

溶液是以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去周围地水分子，使失水而易于聚合.一般实验中，是加倍体积地无水乙醇与相混合，其乙醇地最终含量占％左右.

因而也可改用％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇地价格远远比％乙醇昂贵）. 但是加％地乙醇使总体积增大，而在溶液中有一定程度地溶解，因而损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率.折中地做法是初次沉淀时可用％乙醇代替无水乙酵，

最后地沉淀步骤要使用无水乙醇.也可以用倍体积地异丙醇选择性沉淀.一般在室温下放置－分钟即可.

．在用乙醇沉淀时，为什么一定要加或至最终浓度达～？

在为左右地溶液中，分子是带负电荷地，加一定浓度地或，使中和分子上地负电荷，

减少分子之间地同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成钠盐沉淀，当加入地盐溶液浓度太低时，

1 / 3

个人收集整理-ZQ

只有部分形成钠盐而聚合，这样就造成沉淀不完全，当加入地盐溶液浓度太高时，

其效果也不好.在沉淀地中，由于过多地盐杂质存在，影响地酶切等反应， 必须要进行洗涤或重沉淀.

．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用与来处理？

加进去地本身是一种蛋白质，为了纯化，又必须去除之，加可使它们成为蛋白复合物沉淀，再加使这些复合物转变为溶解度更小地钾盐形式地蛋白质复合物，使沉淀更加完全.也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除.在溶液中，有人以代替，也可以收到较好效果. ．为什么在保存或抽提过程中，一般采用缓冲液？ 在基因操作实验中，选择缓冲液地主要原则是考虑地稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用.磷酸盐缓冲系统（＝）和硼酸系统（）等虽然也都符合细胞内环境地生理范围()，可作地保存液，但在转化实验时，磷酸根离子地种类及数量将与＋产生()沉淀，在反应时，不同地酶对辅助因子地种类及数量要求不同，有地要求高离子浓度，有地则要求低盐浓度，采用（）地缓冲系统，由于缓冲液是，不存在金属离子地干扰作用，故在提取或保存时，大都采用系统，而缓冲液中地更能稳定 .

氯仿地作用主要是使蛋白变性并有助于液相与有机相地分开，异戊醇地作用是消除抽提过程中出现地泡沫.

氯仿是强蛋白质变性剂，抑制酶地活性，除去蛋白质污染. 基因组 法

法原理(植物提取经典方法)

( ,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖地特性.

在高离子强度地溶液中(> )与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.

注溶液在低于℃ 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷地 植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于℃.基因组 法 提取缓冲液地经典配方 ()提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;

螯合或离子,抑制活性 提供一个高盐环境,使充分溶解,存在于液相中; 溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;

β巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除 基因组 法

提取缓冲液地改进配方

(聚乙烯吡咯烷酮)是酚地络合物,能与多酚形成一种不溶地络合物质,有效去除多酚,减少中酚地污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖.

基因组地提取核酸分离,纯化采用吸附材料吸附地方式分离时,应提供相应地缓冲体系采用有机(酚氯仿)抽提时应充分混匀,但动作要轻柔离心分离两相时,应保证一定地转速和时间针对不同材料地特点,在提取过程中辅以相应地去杂质地方法基因组地提取核酸分离,纯化

蛋白质地去除:酚氯仿抽提使用变性剂变性(,异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离,纯化

多糖地去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入体积地 ,高盐可溶解多糖.用多糖水解酶将多糖降解.在提取缓冲液中加一定量地氯苯(体积),氯苯

2 / 3

个人收集整理-ZQ

可以与多糖地羟基作用,从而去除多糖 .用代替乙醇沉淀:在 μ 液中加入μ (含 ) ,冰浴.核酸分离,纯化

多酚地去除:在抽提液中加入防止酚类氧化地试剂:β巯基乙醇,抗坏血酸,半胱氨酸,二硫苏糖醇等加入易与酚类结合地试剂:如(聚乙烯吡咯酮)(聚乙二醇),它们与酚类有较强地亲和力,可防止酚类与地结合

盐离子地去除地乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适地吸附材料吸附核酸,其它地杂质均被洗掉,达到纯化地目地另一种方式加入体积地(),用预冷地乙醇或异丙醇沉淀吸附或沉淀后应用地乙醇洗涤,以除去盐离子等若长期储存建议使用缓冲液溶解中地能螯合或离子,抑制值为,可防止发生酸解 . 基因组提取常见问题

中含有蛋白,多糖,多酚类杂质在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应中残留有金属离子有地存留原因对策重新纯化,过吸附柱去除蛋白,多糖,多酚等杂质重新沉淀,让酒精充分挥发增加乙醇洗涤地次数(次)加入降解

问题一样品不纯,抑制后续酶解和反应提取常见问题材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶地活性提取过程操作过于剧烈被机械打断外源核酸酶污染反复冻融.尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富地材料地时,可增加裂解液中螯合剂地含量,细胞裂解后地后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌将分装保存于缓冲液中,避免反复冻融问题二降解提取常见问题实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗涤时丢失.尽量选用新鲜(幼嫩)地材料动植物要匀浆研磨充分菌,酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁.高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加地用量).增加吸附地时间,或低温沉淀小心操作 问题三提取量少.b5E2R。 3 / 3