内容发布更新时间 : 2024/9/20 1:14:23星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

Bac-to-Bac 表达系统

I. pFastBac-X重组质粒的构建

利用分子生物学技术构建所需的pFastBac重组质粒,以DH5α为宿主,进行扩增.(以下以pFastBac-X为例进行说明. II. pFastBac-x重组质粒的转座步骤： 1. 制备LB琼脂平板。 LB培养液（含Agar）：胰蛋白冻10g/l，Nacl 10g/l，酵母提取物 5g/l，Agar 15g/l 高压灭菌后，培养基温度下降至60℃左右迅速加入下列成分： 卡那霉素 50ug/ml 庆大霉素 7ug/ml 四环素 10ug/ml Bluo-gal 100ug/ml IPTG 40ug/ml

各成分混匀后，乘热在每块平板中加入约20ml培养基，待凝固后放置37℃烘箱干燥产生的水汽。

2. 取出DH10BacTM感受态细胞冰上融解。

3. 用移液枪吸取100ulDH10BacTM感受态细胞于1.5ml EP管。 4. 轻轻加入1ng（约5ul）重组质粒X于感受态细胞中，轻轻敲打管壁使之混匀。 5. 冰上放置30min。

6. 42℃循环水浴静止45秒。 7. 快速放置冰上2min。

8. 在上述管中加入900ul S.O.C.培养基。 9. 将EP管置于37℃摇床（225rpm）4h。

10. 用S.O.C.稀释上述细胞至10－1、10－2、10－3。

11. 在每块LB培养基中加入上述稀释液100ul，涂布均匀。 12. 37℃培养24－48h。（单克隆很小，24h前很难分辨是否为蓝色克隆） 注：1）1、3、4、8、10、11在超净台内进行。

2）用X－gal代替Bluo-gal会降低颜色浓度。真正的白色克隆在菌落长得较大时还是呈白色，建议在黑色背景下进行挑选。

III. 重组Bacmid DNA的分离提取

（在提取前，可以在含Bluo-gal的LB琼脂平板上划板进一步确认） 溶液配置：溶液Ⅰ：Tris-Hcl(15Mm) 0.119g EDTA (10Mm) 0.187g

Rnase (100ug/ml) 0.5ml(贮备液10mg/ml) 用纯水溶解并定容至50ml（调pH8.0）

溶液Ⅱ：NaOH 0.2N SDS 1%

溶液Ⅲ：醋酸钾（3M） 14.7g溶解定容至50ml，pH5.5 TE溶液：

1. 挑取白色克隆于2mlLB培养基（含50ug/ml卡那霉素、7ug/ml庆大霉素、10ug/ml四环素），37℃摇床250－300rpm培养24h以上。

2. 取1.5ml培养物于1.5mlEP管中，14000×g离心1min 3. 倒去上清夜，倒立于吸水纸上。然后加入0.3ml的溶液Ⅰ用枪头轻轻吹打重悬细胞。

4. 加入0.3ml溶液Ⅱ，轻轻混匀，室温放置5min（溶液变清） 缓缓加入0.3ml溶液Ⅲ，轻轻混匀，形成蛋白及DNA沉淀，冰上放置5－10min。 5. 14000g室温离心10min，期间另取一2ml离心管，加入800ul异丙醇。

6. 轻轻把上清液转入含异丙醇的离心管，避免把白色沉淀带入。轻轻倒转离心管数次。冰上放置5min（该过程可放在－20℃过夜）。 7. 室温离心15min

8. 去上清，倒置离心管于吸水纸上，然后加入70％乙醇洗涤沉淀数次，14000g 室温离心5min

9. 尽可能弃去上清，小心操作，勿使沉淀弃去。

10. 使沉淀在空气中自然挥干，5－10min。加40ulTE溶液，轻敲管底，使溶液位于管底部。只要沉淀没有过分挥干，DNA在10min内就可以用了。

注：1）重组Bacmid－X大于100kb，故在操作过程中应避免机械力剪切，破坏重组粘粒的完整性。

2）将提取的Bacmid－X溶液分装，避免冻融次数过多而降低转染效率。

IV. 重组Bacmid－X转染sf9细胞的操作步骤 1. 在六孔板中接种9×105个细胞/2ml/孔。其中培养基Grace’s medium中含有青霉素50U/ml，链霉素50ug/ml，10％FBS。 2. 27℃培养1h，使细胞贴壁。

3. 在这期间制备Bacmid－X与Cellfectin Reagent复合物

a. 用100ul不完全Grace’s medium（不含双抗、FBS）稀释1ug Bacmid－X（约5ul）

b. 在使用前将Cellfectin Reagent倒置5－10次，使其充分混匀，取6ul Cellfectin Reagent用100ul不完全Grace’s medium（不含双抗、FBS）稀释。 c. 将上述两种稀释液合并（总体积约210ul），轻轻混匀，室温孵育15－45min。 4. 在制备Bacmid－X与Cellfectin Reagent复合物期间，将六孔板中的培养基吸掉，用2ml不完全Grace’s medium（不含双抗、FBS）洗涤一次，去掉培养基。 5. 在含有210ul的复合物的管内加入800ul的不完全Grace’s medium（不含双抗、FBS），轻轻混匀，加到每个孔中。 6. 将六孔板内的细胞孵育5h，27℃

7. 去掉复合物混合液，然后在每个孔中加2ml完全培养基（Grace’s medium含双抗、10％FBS）

8. 在37℃湿度培养箱中孵育72h或者直到细胞出现病毒感染迹象。 注：若细胞生长状态不好会影响转染效率，建议在感染前一天将细胞接种于六孔板。

V. P1病毒原种的(P1)分离与贮存 1. 当细胞出现感染迹象时，将上层培养基（约2ml）转移到无菌带盖的EP管中，500g离心5min以去除细胞及大的碎片。可用蛋白结合率低的0.2um的滤膜过滤，滴度损失小于10%。

2. 将含病毒的上清液转移到另一个无菌带盖的EP管中（一般，P1的滴度在106左右）。

将得到的病毒液体避光置于4℃冰箱（短期）。若长期保存，进行1ml分装,避光储存于-70℃。冻融后,在使用前进行滴度检测.

注：若要低温冻存，建议病毒滴度高一点（108－109），因冻存时间长了，病毒的滴度将会下降。

3. 在进行病毒扩增和蛋白表达之前，需进行病毒滴度计算。

VI.病毒滴度测定： 设备： 超净台

40 ℃ 和70℃水浴 27℃ 湿度孵箱 倒置显微镜 材料： 30 ml 5×105 cells/ml 的对数生长期的活力sf9细胞

6孔板 （一次2只）(重复利用六孔板,需用EDTA溶液浸泡,再用酸泡) 1瓶4%的agarose gel

Grace’s medium.(2×)(用Grace’s medium培养基配制) 1瓶过滤灭菌细胞培养级的水 100ml的灭菌空瓶（一次一个）

0.5ml 澄清，不含细胞经过滤(用0.2 Grace’s medium(2×),低蛋白结合滤膜)的病毒上清液。

100 ml的不含FBS和双抗的Grace’s medium(1×) 20 ml的灭活小牛血清

1. 在无菌操作下，每孔加入2ml的悬浮细胞。 2. 室温1h，使细胞贴壁.

3. 微波将胶融化,放置70℃水浴防凝结，将空瓶和 Grace’s medium.(2×)置42℃水浴。(42℃为最适温度)

4. 室温1h 后，在显微镜下观察细胞贴壁，并达到50%的融合。

5. 在0.5ml的病毒上清中加入4.5ml的不含FBS和不含双抗的Grace’s medium(1×)进行稀释，依次，对病毒上清进行10-1至10-8的稀释。（可采用5-ml的管子） 6. 将6孔板和稀释的病毒溶液放置超净台，在两个六孔板上做上相同记号，“10-3， 10-4，10-5，10-6，10-7，10-8”

7. 将每个孔中的上清移走，用PBS(1x)轻轻洗涤,在每个孔中加入1ml相应浓度的病毒溶液，室温孵育1h。

8. 制备覆盖液(以下为一块六孔板的量,通常一次一块板)

准备50℃的水浴(虽然42℃为最适水浴,但由于冬天温度较低, 胶很快凝结, 所以采用稍高一些的温度比较好).当agarose 液化后，将它从水浴中移至超净台，14ml Grace’s medium(2×)+46.6μl的庆大霉素(15mg/ml)+7ml的4%的agarose 胶+4ml 灭菌水+3mlFBS，轻轻地混匀，然后将瓶再放置50℃水浴，直至使用。 6孔板在室温孵育1h后，将6孔板与稀释的胶放置在超净台。

9. 按病毒浓度从低到高移走病毒接种体，放置2ml的稀释凝胶，操作需迅速，以防止细胞单层干燥,并防止气泡的产生。