western blotting实验操作步骤讲解 下载本文

内容发布更新时间 : 2024/6/16 10:03:36星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

蛋白免疫印迹杂交(Western Blot, WB)

WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离,再转移到杂交膜上,然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析,有助于成功完成WB。

A第一部分:蛋白样本提取制备

蛋白样品制备是Western Blotting的第一步,更是决定WB成败的关键步骤,总体原则和注意事项:

1. 尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白(通过采用不同提

取方法或选择不同的试剂盒产品);

2. 保持蛋白处于溶解状态(通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂

等的选择);

3. 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等,(低温操作,加入合适的蛋

白酶和磷酸酶抑制剂);

4. 尽量去除核酸,多糖,脂类等干扰分子(通过加入核酸酶或采取不同提取策

略);

5. 样品分装,长期于-80℃中保存,避免反复冻融。

方法的选择

? 自行配制抽提试剂,根据文献方法或经验提取 ; ? 购买商品化试剂盒,按其说明书的方法提取 。

Example 1:

实验中提取肾脏总蛋白,具体实验过程如下:

1. 提前一天4℃解冻RIPA,一定要完全融化;配PBS(用于细胞试验则需高压); 2. 配制裂解液:PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM(根据样本数配制所需

的量,临用临配);

3. 裂解组织:每个样品称取100mg,加1ml裂解液,匀浆后4℃静置2h使其充分

裂解,14000g,4℃离心10min,取上清。

4. 蛋白定量:取少量上清稀释30倍蛋白定量,然后计算出各样本原液蛋白浓度。

注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂,蛋白定量不能选用Bradford法,可以选用改良的Lowry’s法或者BCA法。

5. 样品蛋白浓度均一化:根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。

具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致,本次蛋白浓度为3mg/ml。 6. 分装并存于-80℃,避免反复冻融。

B 第二部分:

相关试剂的配制:

1. 10%的SDS(戴口罩称取):

称取SDS10g,先加双蒸水80ml,再用磁力加热搅拌助溶,然后定容至100ml。室温保存,如在长期保存中出现沉淀,可在50℃水浴溶化后,仍可使用。 2. 1.5M Tris/HCL(pH8.8)

Trisbase 18.17g,溶解于80ml双蒸水,用浓盐酸调pH至8.8,最后定容至100ml,室温下保存。

3. 0.5M Tris/HCL(pH6.8)

Trisbase 6.06g,溶解于80ml双蒸水,用浓盐酸调pH至6.8,最后定容至100ml,室温下保存。

4. 30%丙烯酰胺/0.8%N,N’-亚甲丙烯酰胺 丙烯酰胺(Acr) 75g 甲叉双丙烯酰胺

2g

加双蒸水150ml,37℃加热溶解后,定容至250ml,查证该溶液pH应不大于7.0,4℃棕色瓶保存。使用时恢复至室温且无沉淀。

Be careful!!!:丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收,其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和口罩。可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能含有少量未聚合材料。 5. 上样缓冲液 0.5mM Trisbase(pH6.8)

甘油 10%SDS

2.5ml 2.0ml 4.0ml

0.4%溴酚蓝(mw669.97) 1ml 二巯基乙醇(mw78.14) 0.5ml 注:配好后分装-20℃保存。 6. 电泳缓冲液

Trisbase 甘氨酸 SDS

10倍储存液

30g 144g 10g

1倍应用液

3g 14.4g 1g

加水至1000ml,PH值用HCl调8.3。已经配制了1000ml的储存液。电泳缓冲