内容发布更新时间 : 2024/7/8 18:08:29星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

琼脂糖凝胶的制备

#配制1*TE电泳及制胶缓冲液（用于电泳的缓冲液和制胶的缓冲液必须是相同的）。

#在三角锥瓶中加入60ml制胶缓冲液+1.2g琼脂糖粉，制成2%琼脂糖。

#在微波炉中加热溶解琼脂糖。（用微波炉加热琼脂糖时，要防止过热引起琼脂糖沸腾溢出。把称量好的琼脂粉先在电泳缓冲液中溶解5-10min，可降低沸腾溢出的可能性）

#使溶液冷却到60度左右，加入5ul 2?（溴化乙锭）溶液。（溴化乙锭见光会分解，致癌物质）

#将琼脂糖溶液倒入灌胶盒中，在适当位置插上梳子。灌胶前要确保灌胶盒放置在水平面上。凝胶厚度一般在3-5mm之间。

（一般琼脂糖凝胶灌注厚度不超过5-7.5mm。一旦凝胶厚度超过0.75cm，样品的转移效率就会降低，需要更长的时间才能使样品充分转移到膜上。） （溶化的琼脂糖是澄清的，在灌胶盒里冷却的过程中会逐步变得不透明。在胶完全凝固之前不要移动灌胶盒）。

（最佳的灌胶方式是在齿梳插入前，把琼脂糖溶液缓慢而匀速的倒入灌胶盒中部，直至整个灌胶盒的表面被覆盖时就可以停止，然后立即插上梳子。会得到均一的没有气泡的凝胶。假如仍然有气泡，可以用灭菌枪头的尖端把气泡挑出或者赶到边缘。）

(配制凝胶时，核糖核酸酶（RNase）可能会污染电泳仪器，特别是齿梳部分。虽然可用某些变性剂抑制核糖核酸酶的活性，但是它们可以转移到或干扰后续的实验部分。如果没有其他情况，梳子必须被浸泡在3%的H2O2或是0.5%SDS、50mmol/l EDTA溶液中，再在使用前用大量的无菌水冲洗。不要使用DEPC或30%的H2O2，它们不仅对电泳槽有损害，对使用者也可能造成危险。)

（灌胶盒一定要清洗干净、烘干，否则灌胶后会看到胶下面有大量气泡，这时因为胶与水不相容）

#室温下使胶凝固（大约30min），然后放置到电泳槽中，倒上电泳缓冲液（电泳缓冲液刚好没过凝胶1mm为好），拔出梳子。

（应给予充分的时间，使胶凝固。拔梳子前把胶浸没在电泳缓冲液中，这样可以减少拔梳子时大气压力造成的影响，降低上样孔底部被破坏的可能性。假如加样孔被破坏却未能察觉，RNA样品上样后会漏掉。）

（用最小体积的电泳缓冲液完全覆盖凝胶。因为电流倾向于走电阻最小的路径，也就是说倾向于绕过而非穿过凝胶。所以过多的缓冲液可以降低电泳速度。 另外要记得检查边缘处的凝胶，凝胶与盒子的边缘结合处会产生倾斜的截面，如果这部分没有完全没在缓冲液中则不能很好的散热，累积的高温效应会融化部分琼脂糖凝胶。

另外要尽量避免在外侧泳道上样，因为凝胶的厚度不均一，外侧泳道的迁移率会不一致（边缘效应）。）

#上样。桌面上铺一张EP手套，先在ep手套上点6*buffer 1ul，然后加上5ul上样样品或actin内参（也就是把buffer稀释到1*，即6*buffer buffer：RNA=1:5）

（尽量减少上样体积。小的上样体积会使RNA样品集中在很小的范围，从而增大分辨率。） （加样时可在电泳槽上上样孔下方放一张黑纸来缓解液面反射带来的不便。）

（所有上样孔必须使用相同组成的上样缓冲液。原因是，与其他样品相比，含有高盐的RNA样品在凝胶中迁移速度减慢。这也是提取RNA过程中要用大量的75%乙醇洗涤RNA沉淀的原因。盐会大幅度改变核酸在凝胶中的移动速率。如果上样时，样品从加样孔中漂起，表明之前沉淀或者洗涤步骤中的乙醇没有去除干净而被重溶在蒸馏水会TE缓冲液中。这就需要重新沉淀样品，70%的乙醇洗涤后充分干燥以除去残留乙醇。只要RNA样品中含有稀释了的乙醇，就很难在凝胶上上样。）

(上样后就不要移动电泳槽的位置，这样会晃动缓冲液，因而会使样品从孔中溢出。)

#跑胶。70-80v。15-20min

(要确保电泳时带有纯负电荷的RNA是从负极移动向正极。即向红色电极方向跑) （观察凝胶或终止电泳时应先关掉电源再操作电泳槽和电泳仪。）

药品的配制：

50*TAE稀释到1*TAE ： 2ul1*TAE+980ul去离子水