内容发布更新时间 : 2024/11/10 4:50:20星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
1 目的
规范微生物限度检验操作,确保检验结果准确、可靠。 2 依据
《中国药典》2015版。 3 范围
本标准适用于微生物限度检验。 4 责任
中心化验室负责人:对本规程的实施负责。
中心化验室检验人员:严格按照本规程执行检验操作。 5 程序
5.1 执行标准:《中国药典》2015版。 5.2 抽样:照《取样标准操作规程》进行。 6 内容
6.1需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数
计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法(MPN法)。检查时,按已验证的计数方法进行供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。 6.1.1设备、仪器及用具 6.1.1.1 设备
微生物限度检测室、净化工作台、生化培养箱(30~350C)、生化培养箱(20~250C)、电热恒温水浴锅、烘箱、脉动真空灭菌柜、紫外灯等。 6.1.1.2仪器及器皿
显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、移液枪及吸头、薄膜过滤器等。 6.1.1.3用具
大、小橡皮乳头,洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。 6.1.2试液 6.1.2.1 消毒液
A.0.1% 新洁尔灭溶液 B.75%乙醇溶液
6.1.2.2稀释液、试剂及配制
A.pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液:取磷酸二氢钾3.56g、无水磷酸氢二钠5.77g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g,加纯化水1000ml,微温溶解,滤清,分装,1210C灭菌15分钟。
B.聚山梨酯80
C.无菌十四烷酸异丙酯 D.pH6.8无菌磷酸盐缓冲液 6.1.3 培养基
胰酪大豆胨琼脂培养基、胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基 6.1.4操作方法 6.1.4.1试验前准备
6.1.4.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、移液枪吸头(1ml、10ml)、量筒、稀释液、培养基等移至传递窗内。每次试验所用物品必须事先计划,准备足够用量,避免操作中出入操作间。
6.1.4.1.2开启微生物检测室紫外灯和空调净化系统,并使其工作不低于30min。 6.1.4.1.3操作人员进入一更,用洗手液或肥皂洗手,烘干。进入二更,用0.1% 新洁尔灭溶液洗手,穿戴洁净无菌服、口罩、手套。
6.1.4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手,再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围,待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。 6.1.4.2供试液的制备
根据供试品的理化特征与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。
常用的供试液制备方法如下。如果下列供试液制备方法经确认均不适用,应建立其他适宜的方法。
6.1.4.2.1水溶性供试试品
取供试品,用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。若需要,调节供试液pH值至6~8。必要时,用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.1.4.2.2水不溶性非油脂类供试品
取供试品,用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:10供试液。分散力较差的供试品,可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80,使供试品分散均匀。若需要,调节供试液pH值至6~8。必要时,用同一稀释液
将供试液进一步10倍系列稀释。 6.1.4.2.3油脂类供试品
取供试品,加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解,或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般不超过40℃(特殊情况下,最多不超过45℃),小心混合,若需要可在水浴中进行,然后加入预热的稀释液使成1:10供试液,保温,混合,并在最短时间内形成乳状液。 6.1.4.2.4肠溶及结肠溶制剂供试品
取供试品10g,加入pH6.8无菌磷酸盐缓冲液,置45℃水浴中,振摇,使溶解,制成1:10的供试液。 6.1.4.3 供试液的稀释
取1:10均匀供试液1ml,加入装有9mlpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的试管中混匀,即为1:100供试液。以此类推,根据供试品污染程度,可稀释至1:1000、1:10000等适宜稀释级。每递增1稀释剂,必须另换一支吸管。 6.1.4.4 检查法 6.1.4.4.1检验量
检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml、cm2)。
一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品,混合,取规定量供试品进行检验。 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g或10ml;膜剂为100cm2;贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时,应从2个以上最小包装单位中抽取供试品。 6.1.4.4.2平皿法
6.1.4.4.2.1 取规定量供试品,按方法适用性试验确认的方法进行供试液的制备和菌数测
定,每稀释级每种培养至少制备2个平板。
6.1.4.4.2.2阴性对照以稀释液代替供试液进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长,应进行偏差调查。 6.1.4.4.2.3 倾注培养基
将预先配制好的培养基(需氧菌总数计数用胰酪大豆胨琼脂培养基,霉菌和酵母菌总数计数用沙氏葡萄糖琼脂培养基)熔化,置45。C水浴中,备用。将45。C左右的琼脂倾注上述各个平皿约15ml,以顺时针或反时针方向快速转动平皿(勿使培养基溢出)使供试液与培养基混匀,放置,待凝。 6.1.4.4.2.4 培养和计数
需氧菌总数计数平板倒置于30~35℃培养箱中培养3~5天。霉菌和酵母菌总数计数