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班级： 临床医学（五年制）1507班 姓名： 刘香贺 学号： 2201150724 流式细胞术的工作原理与发展综述

摘要：流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。是一项多学科交叉研究的结晶。流式细胞术及流式细胞仪的出现融合了医学，计算机学，物理学等众多学科背景。。它不仅测量速度快、准确度好、灵敏度高，而且还具有客观、直接和测量参数多的优点。目前，该技术已普遍应用于肿瘤学、血液学、免疫学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学等领域。本文针对其发展历史及当前应用作一综述。

流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 从其发明到如今在临床和实验室的广泛应用，每一步都凝结了电子技术、流体力学、计算机科学、激光技术、生物学、生物技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识。 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。因其在量上的准确性及其在质上的特异性，流式细胞术在药学，肿瘤学、血液学、免疫学、细胞遗传学、细胞生物学、生物化学，生物材料等众多研究领域得到了广泛的应用也取得了长足的进步。

1. 流式细胞术的工作原理

流式细胞术的基本原理和方法是将待测样品(如细胞、染色体、精子或细菌等)经荧光染料染色后，制成样品悬液，排成单列的样品经流动室的喷嘴喷出成为样品液流，与激光束相交时，样品被激发产生荧光，荧光检测器为光电倍增管，同时还可以光电二极管检测与样品大小有关的散射光，而散射光又分为前向散射光（FS）与侧向散射光（SS）（详见后述）测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。流式细胞术对细胞的分析要基于流式细胞仪才能实现。

流式细胞仪的基本结构分为三部分——液流系统，光学系统，数据处理系统。首先待测细胞或微粒进入液流系统，待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本,在一定气体压力下将待测样品压入流动室,用不含细胞或微粒的缓冲液(又称鞘液)在高压下从鞘液管喷出,鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流成一定角度,使鞘液包绕着细胞或微粒高速流动,形成一个圆形的流束(即鞘流),待测细胞在鞘液的包裹下单行排列,依次通过流式细胞仪的检测区域。（如下图）继而液流进入光学系统，液流通过测量区的细胞被激发而产生荧光，在与入射光束和液柱垂直方向放置光学系统(透镜光栏、滤片、检测器)

用以收集信号（如下图）细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射

的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，（如下图）主要分为前

向散射光和侧向散射光。（前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。）。这些荧光信号的强度代表所测细胞膜表面抗原的强度或其细胞内、核内物质的浓度,经光电倍增管接收后可转换为电信号,再通过模/数转换器,将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机采集所测量到的各种信号进行计算处理,将分析结果显示在计算机屏幕上,也可以打印出来,还可以数据文件的形式存储在硬盘上,以备日后的查询或进一步分析。检测数据的显示视测量参数的不同而有多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达,其x轴为测量的散射光或荧光的强度(可以是线性轴,也可以选择对数轴),纵轴为相对细胞数。一般来说,流式细胞仪坐标轴的分辨率有256或1024通道数,这视其模/数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据,既可以单独显示每个参数的直方图,也可以选择二维的散点图、等高线图或三维的立体视图等。由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。（分选原理如上图5）

2. 流式细胞术的发展历史

流式细胞术是20世纪70年代初发展起来的一项高新技术,80年代开始从基础研究发展到临床医学研究及疾病的诊断和治疗监测。我国在80年代初引进了第一台流式细胞仪。具体发展历程如下[1]：

1930年,Casperrsson和Thorell开始致力于细胞的计数;

1934年,Moldaven是世界上最早设想使细胞检测自动化的人,他试图用光电仪记录流过1根毛细管的细胞数量;

1936年,Caspersson等引入显微光度术;

1940年,Coons提出用结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白; 1947年,Guclcer运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器; 1949年,Coulter提出在悬液中计数粒子的方法并获得专利;

1950年,Caspersson用显微分光光度计在紫外(UV)和可见光光谱区检测细胞;

1953年,Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理,成功地设计红细胞光学自动计数器;

1953年,Parker和Hutcheon描述一种全血细胞计数器装置,成为流式细胞仪的雏形;

1954年,Beirne和Hutchcon发明光电粒子计数器; 1959年,B型Coulter计数器问世;

1965年,Kamemtsky等提出两个设想:(1用分光光度计定量细胞成分;(2)结合测量值对细胞进行分类;

1967年,Kamemtsky和在.Moldaven的方法基础上提出细胞分选的方法; 1969年,Van DillaFulwyler及其同事们在LosALmos,NM(现在的National Flow Cytometry Resource Labs)发明第一台荧光检测细胞计;

1972年,Herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型,能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号;

1975年,Kochler和Milstein提出单克隆抗体技术,为细胞研究中大量的特异性免疫试剂的应用奠定基础。