内容发布更新时间 : 2024/7/4 8:18:06星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

第二次分子生物学实验报告

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

一、 实验目的

1、 学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶

切的操作技术。

2、 学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构

建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。

3、 掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与

方法。

4、 学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。 5、 学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法； 6、 复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；

7、 通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含

有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。

二、 实验原理

1、限制性内切酶

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。

目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。 Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。

Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。

限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。核酸内切限制酶活性的充分发挥受到以下几个因素的影响：

1）DNA样品的纯度，可采取措施有纯化DNA、加大酶的用量、延长酶催化反应的保温时间，扩大反应体积；

2）DNA 的甲基化程度，基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株； 3）酶切消化反应的温度； 4）DNA 的分子结构；

5）限制性核酸内切酶的缓冲液。

限制核酸内切酶是分子克隆中最常用的工具酶，在DNA重组技术中限制性核酸内切酶主要用在一下几方面：①构建重组质粒；②构建基因文库；③DNA 分子的杂交；④制备DNA 放射性探针；⑤绘制DNA 分子的限制酶图谱⑥DNA 序列分析；⑦基因定位及DNA 同源性研究。

2、限制性内切酶的酶切反应

体外构建重组DNA 分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能够得到完整的目的基因。其次，选择具有相应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子作为克隆的载体。常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。

（1）双酶切法：如果只在要克隆的目的DNA 二端具有不同的限制性核酸内切酶的识别位点，而目的基因内部没有相应的识别序列，可用这二种限制性核酸内切酶酶切，则目的DNA可产生二种不同的黏性末端。选择同样具有这二种限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，酶切后，同样产生二个不同的黏性末端，当构建重组分子时，目的DNA 可以一定的方向插入载体中，这样操作效率高，也利于重组子的筛选。

（2）单酶切法：:如果目的DNA 片段只能用一种限制性核酸内切酶切割，酶切后的片段两端产生相同的粘性末端或者平末端。选择具有同样限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，在构建重组分子时，除了形成正常的重组子之外，还可能会出现目的DNA 片段以相反方向插入载体分子中，或者目的DNA 串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象，因此重组效率较低。如果没有很好的方法区分转化子中的重组子，筛选重组子会比用双酶切法构建重组DNA 分子的工作量大很多。

单酶切法和双酶切法各有优缺点，在实际操作时要根据具体情况来定。

3、DNA连接酶

DNA 连接酶能催化双链DNA 片段紧靠在一起的3'羟基末端与5'磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。目前用于连接DNA 片段的DNA 连接酶有E. coli DNA 连接酶和T4 DNA 连接酶。E. coli DNA 连接酶只能催化双链DNA 片段互补黏性末端之间的连接，不能催化双链DNA 片段平末端之间的连接。T4DNA 连接酶既可用于双链DNA 片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA 片段平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。

DNA 连接酶同限制性核酸内切酶一样，都是在体外构建重组DNA 分子所必不可少的基本工具酶。限制性核酸内切酶可以将DNA 分子切割成不同大小的片段，然而要将不同来源的DNA 片段组成新的杂交DNA 分子，还必须将它们彼此连接起来。目前有3 种体外连接DNA 片段的方法：①用DNA 连接酶连接具有互补黏性末端的DNA 片段；②用T4 DNA 连接酶直接将平末端的DNA 片段连接起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA 片poly(dA)-poly(dT)尾之后，再用DNA 连接酶连接起来；③先在DNA 片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成黏性末端，再用DNA 连接酶连接起来。这3 种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA 连接酶所具有的连接和封闭单链DNA 的功能。

4、载体与外源DNA的连接反应

外源DNA 片段与载体分子的连接，即DNA 分子体外重组，主要依赖于DNA 连接酶来完成。DNA 连接酶催化两双链DNA 片段相邻的5’-磷酸和3’-羟基间形成磷酸二酯键。在分子克隆中最有用的DNA 连接酶是来自T4 噬菌体的DNA 连接酶：T4 DNA 连接酶，该酶需要ATP 作为辅助因子。目的DNA 片段与载体DNA 片段之间的连接方式主要有以下几种：

（1）互补粘性末端片段之间的连接

当载体和外源DNA 用同一种限制性内切酶切割时，产生相同的粘性末端，连接后仍保留原限制性内切酶的识别序列；如果用两种能够产生相同的粘性末端的限制酶（同尾酶）切割时，虽然可以有效地进行连接，但是获得的重组DNA 分子消失了原来用于切割的那两种限制性核酸内切酶的识别序列，这样不利于从重组子上完整地将插入片段重新切割下来。定向克隆：根据核酸内切限制酶的性质，用两种不同的限制酶同时消化一种特定的DNA分子，将会产生出具有两种不同粘性末端的DNA 片段。十分明显，如果载体分子和待克隆的DNA 分子都是用同一对核酸内切酶切割，然后混合起来，那么载体分子和外源DNA 片段将按一种取向退火形成重组DNA 分子。

互补粘性末端连接方案中还有一个问题：片段的多拷贝插入。当需要表达蛋白质产物时，多拷贝的插入，在没有拼连剪切信号的情况下，将会导致表达困难或紊乱。所以