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发菜总RNA提取方法的比较与优化

作者:杨佳等

来源:《江苏农业科学》2015年第09期

摘要:发菜是一种具有丰富胶质鞘、色素、多糖的陆生蓝藻。采用Omega RNA提取试剂盒、Trizol RNA提取法、天根试剂盒及优化后的Omega RNA提取试剂盒、Trizol法、天根试剂盒法从发菜藻体中提取RNA,并用核酸浓度测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA质量。结果表明,优化前后的Trizol法均无法提取到发菜总RNA;利用Omega试剂盒获得发菜总RNA已降解;利用天根试剂盒可获得发菜总RNA,进一步改进和优化天根试剂盒的提取程序,获得的发菜总RNA 23S、16S条带清晰,D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm分别为2.06、2.08。研究结果为深入开展发菜转录组研究奠定了基础。 关键词:发菜;总RNA;提取;方法优化

中图分类号:Q781文献标志码:A文章编号:1002-1302(2015)09-0058-03 收稿日期:2014-08-22

基金项目:国家自然科学基金(编号:31360054)。

简介作者:杨佳(1988—),女,山东菏泽人,硕士研究生,主要从事资源植物学方面的研究。E-mail:yangjia713@126.com。

通信作者:梁文裕,博士,教授,主要从事植物资源及植物分子生物学的研究。E-mail:liangwy2009@163.com。生物体性状和对外界环境的响应归根到底是由基因调控的,基因调控主要涉及到核酸、蛋白质等生物分子,高质量RNA是进行基因表达分析的基础。细胞内RNA分子多样性和易被降解的特性决定了RNA提取过程的复杂性[1],RNA酶高稳定性是造成RNA分离困难的主要原因。RNA提取过程中出现的RNA酶有2种来源:外源性RNA酶和内源性RNA酶。外源RNA来自RNA制备过程中用到的玻璃和塑料制品、研究人员本身以及分离过程中用到的试剂或溶液,但这些外源性RNA酶可以通过RNA酶抑制剂处理或使用RNA研究的专用试剂等措施来解决[2-4]。而内源性RNA酶存在于材料本身,如材料的不新鲜会降低RNA的产量,破碎细胞内含物常与RNA形成难溶的物质(多糖类等)导致RNA分离困难[5-6],因此,诸多因素会直接影响RNA的提取效果,增加RNA的提取难度。

发菜(Nostoc flagelliforme)是一种陆生固氮蓝藻,生长在干旱-半干旱荒漠草原地区,具有独特的抗干旱、高温、高光照度、紫外线等非生物胁迫的特性[7]。RNA提取是探索发菜抗逆差异基因表达或转录组研究的重要基础,但由于发菜藻体被较厚的胶质鞘包被,对发菜藻体和细胞的破碎存在一定难度,同时发菜藻体富含的多糖、色素、蛋白质等会以不同方式干扰RNA的提取,从而加大了发菜藻体RNA提取的难度。目前,国内尚无发菜高质量RNA提取

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的相关报道,找到适合提取发菜总RNA的方法具有重要意义。本研究对3种发菜藻体RNA的提取方法进行比较和优化,筛选出最适合发菜RNA的提取方法,为从抗逆差异基因表达或转录组角度研究发菜耐干旱、抗紫外辐射等机理奠定重要基础。 1材料与方法 1.1材料

野生新鲜发菜采自宁夏贺兰山发菜自然生长地。 1.2发菜藻体总RNA的提取及优化

1.2.1Omega试剂盒法提取发菜藻体总RNA将研磨充分的发菜藻体粉末转入Buffer RCL中(含β-巯基乙醇),迅速涡旋振荡,使材料充分裂解,按Omega公司E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit试剂盒说明书中的E.Z.N.A.TM Plant RNA Protocol Ⅱ进行试验。

1.2.2Trizol法提取发菜藻体总RNA按照TRIzol Reagent说明书进行发菜藻体RNA的提取。

1.2.3天根试剂盒法提取发菜RNA将充分研磨至粉末的发菜藻体迅速转移至裂解液SL(含β-巯基乙醇)中,立即涡旋剧烈振荡混匀,按天根公司RNAprep Pure Plant Kit试剂盒步骤提取发菜藻体总RNA。

1.3发菜藻体总RNA提取方法的优化

1.3.1Omega试剂盒方法的优化参照Omega试剂盒法稍作修改。使用700 μL Buffer RCL进行材料的裂解。试验步骤中增加DNase I,即当RNA全部吸附到HiBindTM RNA Mini柱子上后,加300 μL RWC Wash Buffer到柱子上,10 000 g离心1 min,把配好的DNase Ⅰ mix准确地加入柱子中心,室温静置15 min;将HiBindTM RNA Mini柱子放入1个新的收集管中,加400 μL RWC Wash Buffer,静置5 min,10 000 g离心 1 min;最后加入在70 ℃水中孵育的DEPC水进行RNA的提取。

1.3.2改良Trizol法提取发菜RNA对TRIzol Reagent RNA的提取方法稍作修改。向研磨好的发菜细胞中加入1 mL Trizol 后,用涡旋混合器充分混匀,并在冰上放置15 min;55~60 ℃水孵育10~15 min后,4 ℃放置1 h再转移至-80 ℃冰箱备用。

1.3.3天根试剂盒方法的优化参照天根试剂盒法稍作修改。将研磨好的材料加入裂解液SL充分涡旋振荡混匀后,12 000 g 离心3 min;2次加入去蛋白液RW1后,放置1 min再进行离心1 min;用漂洗液RW漂洗3次再空转离心2 min;加入RNase-Free水后于室温放置5 min后离心收集RNA。

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1.4RNA质量和完整性检测

1.4.1琼脂糖凝胶电泳检测分别取RNA样品进行1.0%的琼脂糖凝胶,电泳条件为0.5×TAE缓冲液、160 V恒压、15 min,紫外灯下观察RNA条带并照相记录结果。

1.4.2RNA产量和纯度检测RNA产量和纯度通过核酸浓度测定仪进行检测。通常D260 nm/D280 nm比值在1.8~2.2之间,D260 nm/D230 nm比值在2.0左右,说明RNA纯度较高,D260 nm/D280 nm比值为2.0时质量最高[8]。用RNase free ddH2O作为空白对照,取1 μL RNA样品,用核酸浓度测定仪检测D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm以及RNA的浓度(ng/μL)值。 2结果与分析

2.13种方法提取发菜总RNA质量比较

Omega试剂盒法提取的发菜总RNA样品电泳显示无典型的RNA条带(图1);Trizol法所提RNA无23S、16S条带,只有1条条带,表明RNA完全降解(图2);天根试剂盒法提取的发菜总RNA电泳结果表明,23S、16S条带明显,但条带拖尾现象严重(图3)。 用核酸浓度测定仪分别检测3种方法所提发菜藻体RNA的产量和纯度,检测结果表明,Omega试剂盒所测值均超出了正常值的范围;Trizol法所提RNA相关数据远远低于正常值范围,RNA浓度值较高,说明所提RNA不纯,蛋白质、多糖等杂质污染严重;天根试剂盒法所得数值均正常,且D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm比值接近2.0,说明RNA纯度较高,可进行优化后用于后续的分子试验(表1)。

2.23种方法优化后所提发菜藻体RNA的琼脂糖凝胶电泳检测

优化后Omega试剂盒法所提发菜总RNA(图4)与优化表1不同方法所提发菜藻体RNA的质量及产量检测

方法D260 nm/D280 nmD260 nm/D230 nmRNA浓度 (ng/μL)峰值波长

(nm)Omega试剂盒法2.122.47737.7260Trizol法1.720.53328.3220天根试剂盒法2.071.9397.1260

前(图1)无明显差异,用DNase处理后,仍有杂带,无明显改变,在最下1条亮带以上,能清晰看到4条条带,这与正常RNA电泳条带相异,推测Omega试剂盒不适合发菜藻体RNA的提取;改良后的Trizol法23S、16S 2条带已有大部分降解,5S条带比较明亮,并伴有拖尾现象,表明该方法所提RNA降解快,不适合进行后续试验(图5);优化后的天根试剂