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发菜总RNA提取方法的比较与优化
作者：杨佳等
来源：《江苏农业科学》2015年第09期
摘要：发菜是一种具有丰富胶质鞘、色素、多糖的陆生蓝藻。采用Omega RNA提取试剂盒、Trizol RNA提取法、天根试剂盒及优化后的Omega RNA提取试剂盒、Trizol法、天根试剂盒法从发菜藻体中提取RNA，并用核酸浓度测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA质量。结果表明，优化前后的Trizol法均无法提取到发菜总RNA；利用Omega试剂盒获得发菜总RNA已降解；利用天根试剂盒可获得发菜总RNA，进一步改进和优化天根试剂盒的提取程序，获得的发菜总RNA 23S、16S条带清晰，D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm分别为2.06、2.08。研究结果为深入开展发菜转录组研究奠定了基础。 关键词：发菜；总RNA；提取；方法优化
中图分类号：Q781文献标志码：A文章编号：1002-1302（2015）09-0058-03 收稿日期：2014-08-22
基金项目：国家自然科学基金（编号：31360054）。
简介作者：杨佳（1988—），女，山东菏泽人，硕士研究生，主要从事资源植物学方面的研究。E-mail：yangjia713@126.com。
通信作者：梁文裕，博士，教授，主要从事植物资源及植物分子生物学的研究。E-mail：liangwy2009@163.com。生物体性状和对外界环境的响应归根到底是由基因调控的，基因调控主要涉及到核酸、蛋白质等生物分子，高质量RNA是进行基因表达分析的基础。细胞内RNA分子多样性和易被降解的特性决定了RNA提取过程的复杂性[1]，RNA酶高稳定性是造成RNA分离困难的主要原因。RNA提取过程中出现的RNA酶有2种来源：外源性RNA酶和内源性RNA酶。外源RNA来自RNA制备过程中用到的玻璃和塑料制品、研究人员本身以及分离过程中用到的试剂或溶液，但这些外源性RNA酶可以通过RNA酶抑制剂处理或使用RNA研究的专用试剂等措施来解决[2-4]。而内源性RNA酶存在于材料本身，如材料的不新鲜会降低RNA的产量，破碎细胞内含物常与RNA形成难溶的物质（多糖类等）导致RNA分离困难[5-6]，因此，诸多因素会直接影响RNA的提取效果，增加RNA的提取难度。
发菜（Nostoc flagelliforme）是一种陆生固氮蓝藻，生长在干旱-半干旱荒漠草原地区，具有独特的抗干旱、高温、高光照度、紫外线等非生物胁迫的特性[7]。RNA提取是探索发菜抗逆差异基因表达或转录组研究的重要基础，但由于发菜藻体被较厚的胶质鞘包被，对发菜藻体和细胞的破碎存在一定难度，同时发菜藻体富含的多糖、色素、蛋白质等会以不同方式干扰RNA的提取，从而加大了发菜藻体RNA提取的难度。目前，国内尚无发菜高质量RNA提取
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的相关报道，找到适合提取发菜总RNA的方法具有重要意义。本研究对3种发菜藻体RNA的提取方法进行比较和优化，筛选出最适合发菜RNA的提取方法，为从抗逆差异基因表达或转录组角度研究发菜耐干旱、抗紫外辐射等机理奠定重要基础。 1材料与方法 1.1材料
野生新鲜发菜采自宁夏贺兰山发菜自然生长地。 1.2发菜藻体总RNA的提取及优化
1.2.1Omega试剂盒法提取发菜藻体总RNA将研磨充分的发菜藻体粉末转入Buffer RCL中（含β-巯基乙醇），迅速涡旋振荡，使材料充分裂解，按Omega公司E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit试剂盒说明书中的E.Z.N.A.TM Plant RNA Protocol Ⅱ进行试验。
1.2.2Trizol法提取发菜藻体总RNA按照TRIzol Reagent说明书进行发菜藻体RNA的提取。
1.2.3天根试剂盒法提取发菜RNA将充分研磨至粉末的发菜藻体迅速转移至裂解液SL（含β-巯基乙醇）中，立即涡旋剧烈振荡混匀，按天根公司RNAprep Pure Plant Kit试剂盒步骤提取发菜藻体总RNA。
1.3发菜藻体总RNA提取方法的优化
1.3.1Omega试剂盒方法的优化参照Omega试剂盒法稍作修改。使用700 μL Buffer RCL进行材料的裂解。试验步骤中增加DNase I，即当RNA全部吸附到HiBindTM RNA Mini柱子上后，加300 μL RWC Wash Buffer到柱子上，10 000 g离心1 min，把配好的DNase Ⅰ mix准确地加入柱子中心，室温静置15 min；将HiBindTM RNA Mini柱子放入1个新的收集管中，加400 μL RWC Wash Buffer，静置5 min，10 000 g离心 1 min；最后加入在70 ℃水中孵育的DEPC水进行RNA的提取。
1.3.2改良Trizol法提取发菜RNA对TRIzol Reagent RNA的提取方法稍作修改。向研磨好的发菜细胞中加入1 mL Trizol 后，用涡旋混合器充分混匀，并在冰上放置15 min；55～60 ℃水孵育10～15 min后，4 ℃放置1 h再转移至-80 ℃冰箱备用。
1.3.3天根试剂盒方法的优化参照天根试剂盒法稍作修改。将研磨好的材料加入裂解液SL充分涡旋振荡混匀后，12 000 g 离心3 min；2次加入去蛋白液RW1后，放置1 min再进行离心1 min；用漂洗液RW漂洗3次再空转离心2 min；加入RNase-Free水后于室温放置5 min后离心收集RNA。
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1.4RNA质量和完整性检测
1.4.1琼脂糖凝胶电泳检测分别取RNA样品进行1.0%的琼脂糖凝胶，电泳条件为0.5×TAE缓冲液、160 V恒压、15 min，紫外灯下观察RNA条带并照相记录结果。
1.4.2RNA产量和纯度检测RNA产量和纯度通过核酸浓度测定仪进行检测。通常D260 nm/D280 nm比值在1.8～2.2之间，D260 nm/D230 nm比值在2.0左右，说明RNA纯度较高，D260 nm/D280 nm比值为2.0时质量最高[8]。用RNase free ddH2O作为空白对照，取1 μL RNA样品，用核酸浓度测定仪检测D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm以及RNA的浓度（ng/μL）值。 2结果与分析
2.13种方法提取发菜总RNA质量比较
Omega试剂盒法提取的发菜总RNA样品电泳显示无典型的RNA条带（图1）；Trizol法所提RNA无23S、16S条带，只有1条条带，表明RNA完全降解（图2）；天根试剂盒法提取的发菜总RNA电泳结果表明，23S、16S条带明显，但条带拖尾现象严重（图3）。 用核酸浓度测定仪分别检测3种方法所提发菜藻体RNA的产量和纯度，检测结果表明，Omega试剂盒所测值均超出了正常值的范围；Trizol法所提RNA相关数据远远低于正常值范围，RNA浓度值较高，说明所提RNA不纯，蛋白质、多糖等杂质污染严重；天根试剂盒法所得数值均正常，且D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm比值接近2.0，说明RNA纯度较高，可进行优化后用于后续的分子试验（表1）。
2.23种方法优化后所提发菜藻体RNA的琼脂糖凝胶电泳检测
优化后Omega试剂盒法所提发菜总RNA（图4）与优化表1不同方法所提发菜藻体RNA的质量及产量检测
方法D260 nm/D280 nmD260 nm/D230 nmRNA浓度 （ng/μL）峰值波长
（nm）Omega试剂盒法2.122.47737.7260Trizol法1.720.53328.3220天根试剂盒法2.071.9397.1260
前（图1）无明显差异，用DNase处理后，仍有杂带，无明显改变，在最下1条亮带以上，能清晰看到4条条带，这与正常RNA电泳条带相异，推测Omega试剂盒不适合发菜藻体RNA的提取；改良后的Trizol法23S、16S 2条带已有大部分降解，5S条带比较明亮，并伴有拖尾现象，表明该方法所提RNA降解快，不适合进行后续试验（图5）；优化后的天根试剂