内容发布更新时间 : 2024/12/24 11:28:30星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
密度梯度离心法分离PBMC
1. 在15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液Ficoll。
2. 取5mL抗凝静脉血与5mL无菌PBS按照1:1充分混匀,用移液管沿管壁缓慢叠加于分层液面上,动作一定要轻,注意保持清楚的界面。外周血,PBS,淋巴细胞分离液最终体积比为1:1:1。
3. 水平离心400g×30分钟。(注意:为保证分离效果,需将离心机升降速率调至最低,即升速为1,降速为0,这样调整后,升降速会比较慢,总体离心时间约为1小时。)
4. 离心后可看见管内分为三层,上层为血浆和PBS,下层主要为红细胞和粒细胞,中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图),单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外,还含有血小板。
血浆和PBS
单个核细
淋巴细胞分离液
红细胞和粒细胞
5. 去除部分上层液体(用移液管吸取,不可倾倒),余下约1mL,用移液器插到云雾层,吸取单个核细胞。置入另一15mL离心管中,加入5倍以上体积的PBS,离心300g×10分钟,洗涤细胞两次。
6. 末次离心后,弃上清,加入红细胞裂解液,室温孵育2分钟,裂解红细胞,可根据情况适量增减时间。
7. 加入10mLPBS,离心300g×10分钟,洗涤细胞两次。
8. 末次离心后,弃上清,加入含有10?S的RPMI1640,重悬细胞,计数,计算细胞活力。
胞
用本法分离PBMC,每1mL全血可分离得到1~2×106PBMC,不同人个体之间存在一定差异。活细胞百分率在95%以上。 注意:
1. 所有操作都应在无菌条件下进行。
2. 在分离前Ficoll和PBS等试剂均需在37℃恒温水浴中预热半小时以上。
3. 吸取单个核细胞时不可避免会吸到Ficoll,而Ficoll密度比细胞要大,因此步骤5中需加入足量PBS稀释,若PBS体积太小可能会导致细胞无法离心收集。 4.