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Notch信号通路体外和细胞的药物筛选模型的建立和研究 钮 琦, 吴 方*

(上海交通大学系统生物医学研究院, 上海 200240

摘要: Notch信号通路与生物体的发育及多种癌症的发生密切相关, 目前针对Notch信号通路的药物筛选模

型均以鼠源Notch蛋白为底物, 未见以人源Notch为底物的报道。本文克隆并表达提纯了人源Notch1截短形式

N100, 以之为底物首次构建了Notch信号通路体外和细胞的药物筛选模型。同时, 用已知Notch通路抑制剂对此

模型进行了验证, 得到了相应的IC50值。本研究构建的模型能有效应用于人源Notch信号通路的调控剂筛选, 为

高效发现靶向Notch通路的调控剂奠定了基础。 关键词: Notch信号通路; 癌症; 调控剂; 药物筛选模型

中图分类号: R965.1 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2014 06-0837-06 Establishment of in vitro and cell-based drug screening model for Notch signaling pathway NIU Qi, WU Fang*

(Shanghai Center for Systems Biomedicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China

Abstract: Notch signal pathway is closely related to the organism’s development and a variety of cancers. Current models available for screening modulators of Notch signal

pathway all use mouse Notch protein as substrates and those models which use human Notch protein have not been reported. To make the screen results

much more reliable, the authors cloned a truncated form of human Notch1 called N100, and built the screening models for the use of it instead of mouse Notch protein. The models included an in vitro screening model based

on the purified γ-secretase enzyme and a cell model using luciferase reporter system. The screening models

then have been verified by the known modulators of Notch signal pathway and the IC50 values have been obtained. The verified models can be used to screen modulators of human Notch signaling pathway effectively

and it can lay the foundation for finding new modulators of this kind effectively. Key words: Notch signaling pathway; cancer; modulator; drug screening model Notch信号通路是一类高度保守、不依赖第二信使的信号通路。它由Notch配体蛋白、Notch受体蛋白及下游的转录抑制蛋白CSL构成。当与相邻细胞上的配体结合后, 细胞膜上的Notch受体蛋白发生构象变化, 从而引起之后的两次水解。其中, Notch受体首先被金属蛋白酶 (TACE 在位于胞外区的S2位点剪切, 产生的C端片段再被γ分泌酶在跨膜区的S3

收稿日期: 2014-01-29; 修回日期: 2014-03-18.

基金项目: 国家自然科学基金面上基金资助项目 (31270853.

*通讯作者 Tel / Fax: 86-21-34207545, E-mail: fang.wu@sjtu.edu.cn 位点剪切, 得到的胞内片段进入细胞核, 与CSL结合,

参与下游靶基因表达的激活[1]。

Notch信号通路对癌症的影响具有双重性, 在T 淋巴细胞白血病 (T-ALL 以及如乳腺癌、大肠癌等

多种实体瘤中有致癌作用[2]; 而在肝癌、头颈鳞癌等中, 通过抑制细胞增殖、促进细胞凋亡等来发挥其抑

癌作用[2, 3]。

γ分泌酶对Notch受体蛋白的剪切作为Notch 信号通路必经的一步, 对Notch信号通路发挥其作

用尤为重要。目前已有多种γ分泌酶抑制剂 (GSI ·研究论文·

被尝试用来作为抑制Notch信号通路的抗肿瘤药, 如IL-X (cbz-IL-CHO、三肽γ分泌酶抑制剂 (z-Leu- Leu-Nle-CHO、DAPT、MK0752、RO4929097以及dibenzazepine等。而MK0752则已在复发性、难治的T-ALL以及晚期乳腺癌患者上进行临床I期试验[4, 5]。一种高效的γ分泌酶抑制剂RO4929097也已在一些实体瘤患者的临床I期试验中被证明口服有效[6]。尽管如此, γ分泌酶抑制剂将导致所有Notch同源蛋白的剪切被抑制, 而且Notch受体蛋白也不是γ分泌酶唯一的底物, 因此这类抑制剂类药物会产生如肠毒性这样的副作用[4, 6]。同时, Notch信号通路在癌症中的双重作用也提示, 不仅要寻找Notch通路的抑制剂, 也应寻找其激活剂以应用到Notch发挥抑癌作用的恶性肿瘤中[2]。

目前已有一些体外或基于细胞的检测γ分泌酶剪切Notch受体蛋白的酶活力的方法[7?14], 但都采用鼠源Notch作为底物, 且大多数检测活力的方法没有被Notch通路的γ分泌酶已知抑制剂验证, 因此这些模型具有使用的不确定性和不可靠性。为了解决这一缺陷和更好地发现Notch通路的调控物, 作者克隆了来自人源Notch1的N100 (Notch跨膜区附近的氨基酸; γ分泌酶的直接底物, 并首次构建了相应的体外及细胞水平的γ分泌酶剪切N100模型, 用Notch通路已知抑制剂DAPT和