内容发布更新时间 : 2024/6/28 10:19:22星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

RNAi具有的特征

①RNAi是转录后水平的基因沉默机制；

②RNAi具有很高的特异性，只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA； ③RNAi抑制基因表达具有很高的效率，表型可以达到缺失突变体表型的程度，而且相对很少量的dsRNA分子（数量远远少于内源mRNA的数量）就能完全抑制相应基因的表达，是以催化放大的方式进行的；

④RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点； ⑤dsRNA不得短于21个碱基，并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA，并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰，而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡；

⑥ATP依赖性：在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Dicer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量。

RNAi的生物特性

RNAi抑制转座子活性

两方面的证据提示转座子活性的抑制与siRNA有关

① 发现蠕虫mut-7 基因参与RNAi 并且与转座子的转座抑制有关;

② 在果蝇中, 参与RNAi 的RNA 解螺旋酶Spindle-E 的突变将导致该基因引起的基因沉默的缺失, 同时提高了反转录转座子活性。 RNAi抵御病毒感染

在拟南芥中研究转基因引起基因沉默时发现, sgs2/sde1基因突变的拟南芥对病毒的侵染表现出高度的敏感性 。 RNAi参与异染色质的形成和维持

Hall 等研究表明,着丝粒同源重复序列和RNAi 组分一起正负调节着异染色质的形成并共同促使异染色质组装成核；Vople 等在敲除裂殖酵母( S. pombe) 的RNAi 途径基因( 如Argonaute 、Dicer 、RDRP) 时发现异染色质转录得到的dsRNA可以在RNAi 途径的参与下, 加工成si RNA,si RNA 募集异染色质蛋白1( HP1) , 然后靶向性引起相应异染色质区域的转基因沉默。 RNAi参与机体的发育调控及生理代谢

RNAi 只抑制转录后的基因, 所以RNAi 在生物体发育学研究中具有优势。Chuang 等用RNAi 技术进一步证实了AG、CLV3 、AP1 、PAN 等已知功能基因在拟南芥花发育过程中的功能。在RNAi 过程中形成的RISC 复合物可根据不同情况分别利用si RNA 或stRNA 行使不同的功能, 但最终均导致特定基因沉默。

1.高效性：Elbashir等在研究中发现分别为25 nmol/L与100 nmol/L的起始双链RNA产生的结果是一样的，只是高浓度起始的更有效些。将双链RNA浓度降低到1.5 nmol/L时产生的基因沉默效果变化不大，只有当浓度降低到0.05 nmol/L时，沉默的效果才消失。Holen等也证实1～100 nmol/L的双链RNA浓度对基因沉默的效果是一致的。这说明双链RNA介导的基因沉默效率是相当高的。需要ATP：Zamore等认为RNAi过程中至少有2个步骤需要能量的供给：一是长的双链RNA被 Dicer所酶切产生双链RNA；二是在双链RNA与RISC结合解链后形成有活性的RISC。

⒉特异性：Elbashir等和Brummel kamp等发现在21～23个碱基对中有1～2个碱基错配会大大降低对靶mRNA的降解效果。 ⒊位置效应：Holen等根据人TF(tissue factor）不同的位置各合成了4组双链RNA来检测不同位置的双链RNA对基因沉默效率的影响。在不同浓度和不同类型的细胞中，hTF167i和hTF372i能够抑制85%～90%的基因活性，hTF562i只能抑制部分基因活性，而hTF478i则几乎没有抑制基因的活性。他们还以hTF167为中心依次相差3个碱基对在其左右各合成了几组双链RNA，有趣的是它们所能抑制该基因活性的能力以hTF167为中心依次递减。特别是hTF158i和 hTF161i只与hTF167i相距9个和6个碱基，但它们几乎没有抑制该基因活性的能力。结果还表明双链RNA对mRNA的结合部位有碱基偏好性，相对而言，GC含量较低的mRNA被沉默效果较好。

⒋竞争效应：Hoten等将10 nmol/L和30 nmol/L的hTF167i相比，两者的沉默基因效果无差异，但将20 nmol/L基因抑制效果很差的PSK314i和10 nmol/L的hTF167i相混和后，hTF167i产生的抑制效果明显降低。

⒌可传播性：在线虫中，双链RNA可以从起始位置传播到远的地方，甚至于全身。Feinberg 和Hunter在线虫细胞膜上发现一种跨膜蛋白SID1，它可以将双链RNA转运出细胞，因此系统性的RNAi包括了SID1介导的双链 RNA在细胞间的运输。但在果蝇上并未发现有此基因的同源物，因此在果蝇上通过注射产生的RNAi不能扩散。

植物中RNA干扰具有如下特点：(1)在确定基因功能时具有靶向性，在一个沉默载体中插入部分基因序列就能确定某一基因的功能；(2)能用来选择性地沉默某一基因家族中的单个基因或同时沉默一个基因家族中的多个基因；(3)PTGS能确定在敲除后发生发育早期死亡的基因功能；(4)PTGS具有系统性，可以通过植物的维管系统传递到植物的其它部分；(5)PTGS易于用于大规模、高通量的系统研究。人们通过构建RNAi文库已成功的对线虫胚胎发育进行了研究，此项工作在植物体系的研究中也正不断取得进展。

1. 比同 源 重组法更加简便，周期大大缩短。2.对 于 哺 乳动物，如对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。3. 由于 RNAi能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。4.R N Ai 还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi来阻断某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中起着关键作用。

ＲＮＡｉ 途径主要存在于细胞浆中，与反义核酸、核酶相比，ＲＮＡｉ 具有以下特点。①特异性。ｓｉＲＮＡ 是严格按照碱基配对法则与靶ｍＲＮＡ 结合的，故只引起同源ｍＲＮＡ 的降解。研究表明，在ｓｉＲＮＡ ２１ ～２３ 个碱基中，错配１ ～２ 个碱基就会大大降低干扰效应。②遗传性。ｄｓＲＮＡ 分子可扩散至生物体各个细胞，干扰效应可遗传给后代。研究表明，通过注射或浸泡ｓｉＲＮＡ，在二代线虫中仍可观察到对靶基因的抑制作用［１２］。但这种遗传效应可持续几代以及高等细胞中是否也存在上诉现象尚不明确。③位置效应。研究表明只有针对编码区的ｄｓＲＮＡ 才产生干扰效应，对内含子区域的ｄｓＲＮＡ 不产生干扰效应［１３］。Ｋｅｓｈａｒｗａｎｉ 等［１４］根据人组

织因子（ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ，ｈＴＦ）的不同位置合成了四组双链ＲＮＡ 分别观察其干扰效应，结果显示ｈＴＦ１６７Ｉ 和ｈＴＦ３７２Ｉ 有８５％ ～９０％的基因沉默效率，ｈＴＦ５６２Ｉ 只能抑制部分基因，ｈＴＦ４７８Ｉ 几乎无干扰效应。④放大效应。通过实验研究发现，少量ｄｓＲＮＡ就能够使大量目的基因沉默，即使细胞增殖５０ ～１００ 倍，这种沉默现象仍然存在，表明ＲＮＡｉ 存在扩增机制.

4．1 高度特异性当一段与基因同源的dsRNA注射入果蝇胚胎时，它可以特异性地在果蝇体内干扰靶基因的表达。而其他即使是与靶基因同属一个基因家族的基因都不会受到干扰。 4．2 高穿透性RNAi具有距注射点远距离作用的能力。在线虫中干扰效应甚至可通过生殖系统传递到后代个体。 4．3 高效率性RNA干扰作用是在目的基因被转录后，通过对细胞质中同源mRNA的快速降解，最终由于该基因缺少mRNA而无法产生蛋白质产物。果蝇的RNAi实验结果在2～3d即可以得到结果，这是其他传统实验技术所无法比拟的。 4．4 高稳定性以3’端悬垂，rI’碱基的dsRNA尤为稳定，无需像反义核酸那样进行广泛的化学修饰以提高半衰期。