内容发布更新时间 : 2024/10/25 9:39:55星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

E.Z.N.A Plasmid Miniprep Protocol 质粒小规模提取试剂盒 Product Number D6942 and D6943,D6944注意：

1． 使用之前，把试剂盒中的一小管RNA酶加入溶液Ⅰ. 4℃保存 2． 加60ml 100%乙醇到DNA Wash Buffer Concentrate中. 室温保存 除试剂盒外还需准备：可达到13000×g的离心机 无核酸酶的离心管 无菌去离子水或TE缓冲液 纯乙醇

操作规程：(提取过程在室温下进行)：

1.在10-20ml试管中，将携带有所需质粒的E.coli接种到5ml LB培养基LB（含氨苄青霉素50μg/ml），37co振荡培养12-16h。需特别指出的是：endA阴性的E.coli菌株用于常规质粒提取，如DH5α和JM109.

2. 取1.5~5ml菌液室温10000×g离心1min，去上清

3. 加250μl溶液Ⅰ（含RNase A），涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。（用移液枪吹打进行重悬浮）

4.加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4~6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min，剧烈混合会使剪切染色体DNA，降低质粒纯度。(储存溶液Ⅱ应拧紧瓶盖) 5.加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀

6.室温13000×g离心10min，紧凑的白色沉淀就会形成，迅速进行到下一个步骤

7.特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱

8.弃滤过液，加500μl Buffer HB，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度以备后续试验使用。

如果接下来的步骤对质粒纯度要求不高，如酶消化法等其它筛选方法，此步可省略 9.弃滤过液，再用100%乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min，弃过滤液。注意：Wash Buffer浓缩液用前必须用纯乙醇稀释，方法见标签 如果经过冷冻，用前必须恢复室温

10.此步可选：再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱

11.必须将吸收柱13000×g离心2min确保乙醇被去除，乙醇会影响下面的步骤。 12.将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加30-50μl(取决于需要的终浓度)Elution Buffer或无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，室温静置1-2min。13000×g离心1min。一次可洗脱75-80%附着DNA（可进行再洗脱，但会降低DNA浓度）。 13. 检测：

方法A：分别在260nm和280nm波长下测定20-50倍稀释液的吸光度 DNA浓度＝260nm吸光度×50×稀释因子μg/ml

高质粒拷贝数能达到5ml培养液得到25μg DNA，如果260nm吸光度/280nm吸光度大于

1.8，说明核酸大于90%。

方法B：和预知浓度DNA样品（Marker）一起做琼脂糖凝胶/嗅化乙啶电泳，对比结果 （通常情况得到的DNA是单体超螺旋，也有少量多联体）

D6943-01* 100Preps(V-Spin) 稀释WB，加80mL的无水乙醇