内容发布更新时间 : 2024/5/19 6:27:33星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

淀粉酶活性的测定

一、实验目的

酶的活力是酶的重要参数，反映的是酶的催化能力，因此测定酶活力是研究酶的基础。酶活力由酶活力单位表征，通过计算适宜条件下一定时间内一定量的酶催化生成产物的量得到。

淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。α-淀粉酶是一种典型的内切型淀粉酶,主要作用于淀粉水解的液化阶段,因此又叫液化酶。作为一种最重要的工业酶制剂，α-淀粉酶广泛存在于动物,植物和微生物中。其中，微生物α-淀粉酶以其经济易得成为工业生产主要来源。目前,关于α-淀粉酶活性的测定方法很多种。

本实验采用杨氏改良法测定α-淀粉酶；掌握测定α-淀粉酶活性大小与温度关系的方法，通过分析得出酶的最适温度范围。 二、实验原理

酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和pH值称为某种酶作用时的最适温度和pH值。温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低，其变化趋势呈钟形曲线变化。

不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。

本实验通过淀粉遇碘显蓝色，淀粉含量越高，颜色越深。用分管光度计检测显色效应大小，通过分管光度值计算酶活力

注意：实验中为了消除非酶促反应引起的淀粉水解带来的误差，每组实验都做了相应的对照实验，在最终计算酶的活性时以测量组的值减去对照组的值加以校正。

在实验中要严格控制温度及时间，以减小误差。并且在酶的作用过程中，三

支测定管及空白管不要混淆。 三、材料、试剂与仪器 实验材料：α-淀粉酶

仪器：分光光度计、电热恒温水浴锅、小台秤、研钵、玻璃仪器若干 试剂：

① 0.4M NaOH/0.4M CH3COOH及0.1M HCl：

② 0.005%工作碘液：0.5克I2和5.0克KI水中研磨，定容至1000mL； ③ 1%糊化淀粉溶液：称取1.0克淀粉，加入25mL0.4M NaOH，60℃5min，冷却后加25mL0.4M CH3COOH，定容至100mL； ④ 稀释α-淀粉酶溶液：待测样品 四、实验步骤

① 10mL1%淀粉溶液加入试管中，室温25/45/65℃保温10min

②于每管中各加酶稀释液1mL，在室温25/45/65℃恒温水浴中（水浴温度的变化不应超过±0.5℃）准确加热10min，冷却。

③加1mL1M盐酸终止反应。

⑤ 取上述混合液1mL加入预先装好10mL工作碘液的试管，摇匀。

⑥ 660nm测吸光度（蒸馏水调零），记录数据。（注：吸光度测定勿漏空白对照组）

对照组为不加酶液，加相应体积的水 五、数据整理及计算 温度（℃） OD660 对照组OD0660 25 45 65 根据以上的数据整理的结果，结合以下公式计算两种淀粉酶的活性：

酶活=[(D0-D)*100/D0*10]*稀释倍数

D—反应混合液吸光度 D0—对照组吸光度 100—系数(%) 10—反应时间

酶活定义：1克α-淀粉酶单位相当于在pH 5.0，温度25、45、65℃，1 min将浓度为1%的淀粉溶液的显蓝强度降低1%时所需酶量。