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RNA干扰技术及其应用 柳满 生物制药1201 1202150124

摘要：1998年Andrew．Fire和Craig C．Mello发现双链RNA可以抑制线虫同源基因的表达使基因沉默，并且沉默可遗传给后代。现将这类小干扰RNA分子可以高效、特异地阻断体内同源基因表达，促使同源mRNA降解，诱使细胞表现出基因缺陷的表型现象称为RNA干扰。本文从RNAi的发现、机制、生物学功能、应用来论述RNAi。转基因沉默现象最初在植物中被发现。RNAi的作用机制：dsRNA进入细胞内被Dicer酶切割成siRNA。siRNA的双链结构被解螺旋与沉默复合物形成复合物，siRNA双链被解开，然后特异性结合到靶RNA上，切割RNA。mRNA剪切过程中新形成的21-23个siRNA又可以进入下一轮循环而达到扩增效应的目的。生物学功能：沉默、机体内源性基因表达。RNAi的应用：基因功能的研究、基因剔除、医学方面的应用、RNAi药物。

关键词：基因沉默 RNAi siRNA miRNA

以前我只知道遗传物质有DNA、RNA，亦只知道RNA的功能是转录。但随着知识的增多，我了解到原来蛋白质也是一种遗传物质，例如Prion蛋白。Prion学说的出现使得蛋白质不仅体现生物学功能，而且可储存遗传信息。 PrPC蛋白高级结构的改变不仅可造成蛋白功能的变化，在某种意义上还是遗传信息传递的方式。我亦知道了不是所有的RNA都是单链的，更知道了RNA的功能不仅仅只是转录。通过学习分子生物学检测技术，我知道了RNA干扰现象的发现、作用机制、应用等。1998年Andrew．Fire和Craig C．Mello发现双链RNA可以抑制线虫同源基因的表达使基因沉默，并且沉默可遗传给后代。现将这类小干扰RNA分子可以高效、特异地阻断体内同源基因表达，促使同源mRNA降解，诱使细胞表现出基因缺陷的表型现象称为RNA干扰。2006年10月2日，瑞典皇家卡罗林斯卡(Karolinska)医学院宣布，将2006年度诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁·费里(Andrew．Fire)和克拉格·米洛(Craig C．Mello)，以表彰他们在1998年的重要发现。瑞典皇家卡罗林斯卡医学院在颁奖声明中宣称，费里和米洛的发现能解释许多令人困惑、相互矛盾的实验结果，并提示了控制遗传信息流动的自然机制。RNAi的很多领域还是未知的，这有待于我们一代一代人的不断努力，去揭开其神秘的面纱，为我们自己提供更好的医疗条件等。

一.RNA的起源 秀丽新小杆线虫中的RNAi途径

转基因沉默现象最初在植物中被发现。研究人员在植物中导人额外的产生特定色素的基因，试图创造一种深色的花朵，结果发现，所有导入的额外基因连同

内源性基因都被沉默(Napoli et a1．，1990；Van der Krol et a1．，1990)。线虫中的转基因通常能在成体组织中表达，而在幼虫中表现沉默(Kelly and Fire，1997)。共抑制，即沉默和转入片段序列相同的内源基因，这一现象也在线虫的幼虫中被观察到(Ketting and Plasterk，2000；Dernburg et a1．，2000)。在秀丽新小杆线虫的每个细胞中导人几个小分子dsRNA(Fire et a1．，1998)就能产生显著的反应。这一结果表明在整个生物体中存在着一条应答基因沉默的调控通路。Mello实验室检测得到两类RNAi缺陷型(rde)突变体(Tabara eta1．．1999)。第一类由rde-1和rde一4组成，仅涉及RNAi途径，不参与其他过程。第二类突变体包括rde-2、rde-3和mut一7，它们仅参与幼体的RNAi过程。这类突变体也具有一个增变突变体的特征，即雄性线虫常表现为温度依赖的不育，而生殖细胞却呈现正常沉默的转位子的移动(Collins et a1．，1987；Kettinget a1．，1999)。Ketting等人于1999年证实多数增变突变体不发生基因沉默。秀丽新小杆线虫中RNAi的重要特征之一是具有可遗传性。将靶向调节母体中胚胎发育基因的dsRNA注入雌雄同体线虫内会导致母体中的胚胎死亡。然而，RNAi效应不会瞬间生效，大约12h后生物体发生变化，继而导致后代死亡。在注射后4～12h产生的后代也可能受到影响，因此，当它们成年后会产下死亡的卵。这种生物体称为RNAi效应“携带者”。Kell和Fire证明导入线虫的DNA序列的可遗传特征是由于有效的基因沉默，同时他们也证实只要转基因与基因组DNA混合后一起注入就能获得表达线虫幼虫转基因的转基因动物。其他研究组报道利用粒子轰击而不是传统的注射方法所得到的转基因动物能够持续表达单拷贝的转基因(Praitis et a1．，2001)。

二.RNAi的作用机制

1.起始阶段 在起始阶段，外源的dsRNA通过导入或者转基因、病毒感染、转座子活化及特异重复序列及特异重复序列或其他未知方式进入细胞。引入的dsRNA被核酸酶RNnase III家族中特异识别，后者以一种ATP依赖的方式逐步将dsRNA切割成长21-23个核苷酸的有正反义链组成的双链小分子干扰RNA，且

每条单链的3'd都带有2个突出的非配对碱基（多数是UU）。siRNA是识别靶RNA的标志，它的生成启动RNAi反应。

2.效应阶段 siRNAs的双链结构需被解螺旋后组装到RNA诱导的沉默复合物中，形成一复合物，此复合物由内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶和同源RNA搜索活性蛋白4种蛋白成分组成。在ATP存在下，该复合物中解旋酶活性将siRNA双链解开，并定位到siRNA的反义链互补的靶RNA转录本上，在距离siRNA双链3'端12个碱基的位置切割mRNA.

3.倍增阶段 以往许多实验发现仅需少量siRNA即可引起强烈的同源基因表达抑制，研究者推测在mRNA剪切过程中产生的21-23个核苷酸片段可能会作为新的siRNA而继续参与RNAi过程，从而使干扰作用放大，存在倍增放大机制。

我对于机制简单的理解既：dsRNA进入细胞内被Dicer酶切割成siRNA。siRNA的双链结构被解螺旋与沉默复合物形成复合物，siRNA双链被解开，然后特异性结合到靶RNA上，切割RNA。mRNA剪切过程中新形成的21-23个siRNA又可以进入下一轮循环而达到扩增效应的目的。

关于扩增反应：最近，至少在一些研究中发现扩增反应的存在。次级siRNA可能通过称为过渡性RNAi(transitiveRNAi)的机制产生。其过程可能是siRNA或短的反义RNA可发挥启动特异性依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRP)合成与被靶定序列互补的RNA(cRNA)共同重新合成产生dsRNA的作用，然后通过DCR裂解成新的siRNA。也有新的证据表明有些RdRP也能非常高水平地进行特异性转录或在检测到如病毒入侵的异常RNA存在的情况下不需要启动子就能产生cRNA。最早提出的这种设想是用来解释植物转基因产生的PTGS现象。推测对细胞带来的优势是更多的mRNA引发并导致更多的靶基因失活，使得细胞更有效地清除感染的病毒。

三.RNAi生物学功能

RNA沉默突变体的筛选最早是在放线菌中进行的，最近在线虫和果蝇中也有所发展，并导致确定了几种RNAi应答相应蛋白质必需的基因，包括DCR、RdRP、RISC及各种解旋酶等。沉默包含的连续遗传学途径分析阐明了这些不同功能成分发挥作用的前后顺序及一些新的功能。有些RNAi相关基因缺失突变表现出一