内容发布更新时间 : 2024/12/24 10:35:26星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
pUC18 和 pUC19质粒图谱
pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的质粒载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注册号为 L08752（pUC18）和 X02514（pUC19）。由 pBR322 改造而来，其中 lacZ （MSC）来自 M13mp18/19 图 3-4 是其质粒图谱。
这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反。这些质粒缺乏控制拷贝数的 rop 基因，因此其拷贝数达 500-700 。 pUC 系列载体含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现 α-互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过 α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。
特征序列区位：
pBR322_origin Ampicillin lac_promoter
1471 - 852 2486 - 1626 543 - 514
AmpR_promoter 2556 - 2528
M13_pUC_rev_primer 500 - 478 M13_reverse_primer 479 - 461 M13_forward20_primer 379 - 395 M13_pUC_fwd_primer 364 - 386 lacZ_a pGEX_3_primer Orf2
NOS terminator sequence:
ggatccatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttgtttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacacgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagtaatcgat
398 - 250
51 - 29
2486 - 1626
设计引物：
Forward primer: 5’ ggaGGATCCggatccatcgttcaaac 3’ (含BamH I 位点GGATCC及三个保护碱基)
Reverse primer: 5’ atcGAATTCATCGATTACTAGTAACATAG 3’ (含EcoR I 位点GAATTC及三个保护碱基)
请查一下NOS终止子序列内有没有这两个酶切点。如果没有，引物合成后，以任何一种pCAMBIA为模板都能扩增到该终止子序列。
一、质粒的基本特性 1．质粒的复制
通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子）。在不同的质粒中，复制起始区的组成方式是不同的，有的可决定复制的方式，如滚环复制和 θ 复制。在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。图 3-1 是其复制其始示意图。
在复制时，首先合成前 RNAⅡ ，即前引物，并与 DNA 形成杂交体；而后 RNase H 切割前 RNAⅡ ，使之成为成熟的 RNAⅡ ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。形成的 RNAⅠ 可控制 RNAⅡ 形成二级结构，同时 Rop 增强 RNAⅠ 的作用，从而控制质粒的拷贝数。削弱 RNAⅠ 和 RNAⅡ 之间相互作用的突变，将增加带有 pMB1 或（ColE1）复制子的拷贝数。
图 3-1 带 pMB1（或 ColE1） 复制起点的质粒在复 制起始阶段所产生的转录的方向及其粗略大小。 2．质粒的拷贝数
质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限，大约 1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。表 5-1 就是不同类的质粒与复制子及拷贝数的大致关系。
表 3-1 ：质粒载体及其拷贝数
质粒 pBR322 及其衍生质粒 pUC 系列质粒及其衍生质粒 pACYC 及其衍生质粒 pSC101 及其衍生质粒 ColE1 复制子 pMB1 突变的 pMB1 p15A pSC101 ColE1 拷贝数 15～20 500～700 10～212 ～5 15～20
pUC 系列质粒的复制单位来自质粒 pMB1 ，但其拷贝数较高。 pMB1 质粒的复制并不需要质粒编码的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期较长的酶（DNA 聚合酶 Ⅰ ，DNA 聚合酶 Ⅲ），依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶，以及宿主基因 dnaB 、 dnaC 、 dnaD 和 danZ 的产物。因此，存在抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素或壮观霉素等抗生素时，带有 pMB1（或 ColE1） 复制子的质粒将继续复制，最后每个细胞中可积聚 2～3 千个质粒。 3．质粒的不相容性