内容发布更新时间 : 2024/7/1 1:46:59星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

Human CRISPR Knockout Pooled Library (Brunello)

一、

lentiCas9-Blast

质

粒

的

基

本

信

息

：

http://www.addgene.org/pooled-library/broadgpp-human-knockout-brunello/

由于cas9自待的抗性基因是我们不需要，在抗性基因两边突变出酶切位点，酶切掉原本的抗性基因。换成另一种。

1. lentiCas9-Blast质粒购买来时是以细菌的形式存在的,先需要扩大培养。 2. 试剂盒提取质粒，并测定浓度。

二、 慢病毒包装质粒

1 转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293T细胞，调整细胞为

7*105在5ml的DMEM培养基中。37 ℃ 、 5% CO2 培养箱内培养。待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。 2 转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。

3 向离心管中加入质粒DNA和等体积的Opti-MEM，混匀，调整总体积为 2.5

ml，在室温下温育5分钟。

4 将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100 μl Lipofectamine 2000试剂

在另一管中与2.4 ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。

5 把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒

混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。

6 混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀

释液的转染复合物。

7 DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，

于37 ℃, 5% CO2 细胞培养箱中培养。

8 培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，

轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。 9 每瓶细胞中加入含10% 血清的细胞培养基25 ml，于37 ℃ 、 5% CO2 培

养箱内继续培养48小时。

10 收集转染后48小时（转染即可为0小时计起）的293T细胞上清液。 11 于4 ℃，4000 g 离心10 min，除去细胞碎片。 12 以0.45 μm滤器过滤上清液于15ml 离心管中。

三、 慢病毒转染细胞

参考网址：http://www.addgene.org/protocols/generating-stable-cell-lines/