内容发布更新时间 : 2024/12/25 13:04:44星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

实验报告

MTT实验 一、实验原理

MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm。波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT0.5克，溶于100 mL的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。MTT一般最好现用现配，过滤后放4℃，避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时

间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。 配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解。

PBS配方：NaCl 8g＋KCl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g调pH 7.4，定容1L。 二、实验目的

1. 利用胶束测试细胞毒性(MTT法)，选择的细胞为：HeLa细胞、L929细胞和HepG2细胞，测试48 h内不同聚合物胶束浓度下细胞的存活率。

2. 制备含有负载不同浓度的DOX药物载体，利用MTT法，选择的细胞为：HeLa 细胞、L929细胞和HepG2细胞，测试48 h内负载不同浓度DOX的药物载体细胞的存活率。

3. 对于负载药物的DOX药物载体，利用CLSM(共聚焦激光扫描显微镜)，观察在0.5 h, 1 h, 2h, 4 h, 8h细胞中的成像问题。 三、实验方法

将状态良好的细胞消化，用培养液稀释至3×104cells/mL细胞密度，吹匀后于96孔板中每孔加入细胞悬液100 μL，置培养箱中孵育24 h使其贴壁。待细胞贴壁后加药。本实验中药物溶液与胶束制剂的配制和稀释均用培养液，并用0.22 μm滤膜无菌过滤。受试溶液每孔加入100μL，每个浓度3个平行孔；对照组，即不加待测药液，单一补加100μL培养液,置培养箱中和细胞共同畔育。于加药后48、72和96 h，将96孔板取出，每孔加入2 mg/mL MTT溶液50μL，置培养箱中鮮育4 h后甩板，将96孔板倒扣于滤纸上充分吸干残留液体后，每孔加入200μL DMSO于振荡器上振荡10 min以溶解蓝紫色结晶物。设定A1孔(只含有200μLDMSO)为调零孔。使用酶标仪在570 nm处测定各孔调零后的吸光度值。三、配置不同浓度的胶束以及负载不同浓度DOX的药物载体，使终浓度分别为0.1、1、10、100、500μg/mL。精密称取一定质量的聚合物材料，通过透析法或者溶剂挥发法制备聚合物胶束，量取一定量的浓溶液并稀释为一系列浓度的聚合物溶液，用0.22μm无菌滤头过滤除菌后，待用。取处于对数生长期的细胞，适量胰蛋白酶消化后计数，加入适量RPMI1640培养基稀释为细胞浓度为80000个/mL的细胞悬液，于96孔细胞培养板上每孔各接种100 μL稀释好的细胞悬液，即每孔含8000个细胞。培养4h待细胞贴壁60后,各加入l(HiL待测聚合物囊泡

溶液,使终浓度分别为0.1、1、10、100、500μg/mL。培养板的最外周孔加200μL PBS，实验室仅使用外周孔之内的孔。且每个浓度均设5个复孔，并设置5个阴性对照孔(无细胞，只加培养基，不加实验样品溶液)，5个阳性对照孔(细胞混悬液，但不加实验样品溶液)。分别培养24h、48h、72h后，于酶联免疫检测仪上570 nm处测定吸光度值。 药物MTT法实验步骤 1贴壁细胞：

(1).收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μL，铺板使待测细胞调密度1000- 10000 /孔，（细胞浓度的问题见后面的注意事项）。

(2). 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板），加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午）加药.一般5-7个梯度，每孔100 μL，设3-5个复孔。建议设5个，否则难以反应真实情况。

(3). 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。

(4). 每孔加入10 μL MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

(5). 终止培养，小心吸去孔内培养液。

(6). 每孔加入100 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。

(7). 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。 2悬浮细胞：

(1). 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/mL（细胞浓度的问题见后面的注意事项），按次序将①补足的1640（无血清）培养基40 μL；②加Actinomycin D（有毒性）10 μL用培养液稀释 (储存液100mg/mL，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10 μL；④细胞悬液50 μL（即5×104cell/孔），共100 μL加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640培养液）。 (2). 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。