内容发布更新时间 : 2024/11/14 23:49:03星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存

注：1. 缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;

2. 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;

待转化毕氏酵母的制备

1. 接种环接种Pachiapastoris于YPD平板，30℃培养2d;

2. 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；

3. 取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；

4. 室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；

5. 重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻， 6. -70℃保存

毕氏酵母的转化

1. 将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率； 2. 37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次； 3. 取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀； 4. 30℃水浴孵育1h；

5. 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中； 6. 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中； 7. 将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；

毕赤酵母转化方法有4 种。最常用的是电转化法和原生质体法,其中电转化法最为方便,转化效率最高,最容易产生多拷贝整合。由于原生质体法必须首先制备去除细胞壁的原生质体细胞以利于DNA 进入,然后细胞再生细胞壁,产生转化体,而ZeocinR 抑制细胞壁的形成,导致不能产生转化体。因此利用ZeocinR作为选择标记的载体如p PICZ 系列,不能使用原生质体法进行转化