内容发布更新时间 : 2024/12/23 23:31:21星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
未污染的新鲜、试剂级DMSO,-70℃保存
注:1. 缓冲液A、B、C均用滤膜过滤,-20℃保存;
2. 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞,其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;如进行多样品的转化,建议按6样品/组进行);
待转化毕氏酵母的制备
1. 接种环接种Pachiapastoris于YPD平板,30℃培养2d;
2. 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中,30℃振荡培养过夜;
3. 取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养,待其OD值从0.1升到0.5~0.8;
4. 室温下3000g离心收集酵母菌体,50ml缓冲液A洗涤一次;
5. 重悬菌体于4ml缓冲液A中,按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中,每管加入11ulDMSO,混合后迅速于液氮中冷冻, 6. -70℃保存
毕氏酵母的转化
1. 将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中,直接加于冻结的酵母细胞中;加入担体DNA(40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA)以获得最大转化率; 2. 37℃水浴孵育5min,中间混合样品1~2次; 3. 取出离心管,加入1.5ml缓冲液B,彻底混匀; 4. 30℃水浴孵育1h;
5. 室温下2000g离心10min,去除上清液,菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中; 6. 离心样品,去除上清液,轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中; 7. 将所有转化液铺于选择性平板,于30℃孵育3~4天后,鉴定;
毕赤酵母转化方法有4 种。最常用的是电转化法和原生质体法,其中电转化法最为方便,转化效率最高,最容易产生多拷贝整合。由于原生质体法必须首先制备去除细胞壁的原生质体细胞以利于DNA 进入,然后细胞再生细胞壁,产生转化体,而ZeocinR 抑制细胞壁的形成,导致不能产生转化体。因此利用ZeocinR作为选择标记的载体如p PICZ 系列,不能使用原生质体法进行转化