内容发布更新时间 : 2024/12/23 12:11:54星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

毕赤酵母表达系统使用心得

PichiaPichiaPichiaPichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高但是在实际操作中并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题收集了部分用户在使用EasySelectPichiaExpressionSystem这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中XiangYang是来自美国乔治城大学

GeorgetownUniversityLombardi癌症中心LombardiCancerCenter部分用户来自国内。甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统具有一定的蛋白质翻译后加工有利于真核蛋白的表达优点-2.AOX强效启动子外源基因产物表达量高可以达到每升数克表达产物的水平3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物远较真核系统简单非常适合大规模工业化生产。4.可以诱导表达也可以分泌表达便于产物纯化。5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源生产成本低表示优胜于-表示不如表示差不多EasySelectPichiaExpressionSystem产品性能优点——使用简单表达量高His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种一方面由于其是属于真核生物因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰另一方面毕赤酵母生长速度快可以将表达的蛋白分泌到培养基中方便蛋白纯化。毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点MCR3端带有his-tag和c-mycepitopes这些tag有利于常规检测和纯化而且在MCR5端引入了

alphafactorα-factor用以增加表达并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候如果你选择的是EcoRI那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序

列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。第一步————————构建载体XiangYangpPICZ系列有许多克隆位点可供选择同时也有三种读码框以便不用的用户需要。红叶山庄有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列pPIC9K属于穿梭质粒也可以在原核表达而pPICZ系列比较容易操作大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选PIC9K操作麻烦一点大肠用amp抗性而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆在利用G418筛选多拷贝而且对于大小合适30—50KD的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。leslie要做毕赤酵母表达实验首先当然就要了解这个可爱的酵母了椭圆形肥嘟嘟的十分可爱她和大肠杆菌长得有较大区别大肠杆菌是杆状的因此在培养的过程中要区别这两种菌体除了气味浓度颜色以外也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧表达过程中染菌我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌那真是一段可怕的经历如果在不知情的情况下继续做下去那可以就是浪费大把的时间了。基本熟悉了毕赤酵母了解了她生长的喜好多糖偏酸环境生长的周期等等情况后当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上我的表达蛋白有些恐怖有100KD本来当然应该放在大肠杆菌中表达但是为了分泌表达其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错和糖基化修饰主要是这个方面因为我的蛋白是人源的表达出来用于酵母双杂因此需要有完备的糖基化修饰。这样我的DNA片段由于较长所以在做克隆的时候也要非常小心需要注意的是?酶切位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免可以采用平末端连接?虽然α-factor可以自动切除但是在设计表达的时候如果在N端不能出现任何多余的aa比如

药物蛋白表达需要特别留意说明书上有详细说明P13?有三种不同的读码框对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确这可是致命的问题?无论pPICZ还是pPICZα都有TGA终止密码子但

是pPICZ系列没有ATG起始密码子有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利?如果不希望有c-myc和His-tag可以在基因片段末尾加入终止密码子?Pichia的密码子与酿酒酵母的相似有关基因表达偏好密码子的问题有人认为没有必要更换有人认为一定要换个人认为以产量为主要目的的可以考虑更换基因密码子而如果片段过长就比较麻烦不过有许多真核保守蛋白其实是和酵母密码子相似的?克隆菌株需要有recAendA试剂盒带有的TOP10挺好用的其它像是DH5α都行但是要注意带有筛选抗生素Zeocin的培养基要用低盐培养基NaCl减半这主要是因为怕影响到抗生素作用Zeocin平板要避光保存?测序引物可以用α-factor信号引物也可以用5AOX1引物?如果需要高量表达可以考虑做克隆的时候串联基因片段进行表达另外也可以在转化酵母的时候重复转化。?目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr这样的序列因为这个序列是激活蛋白水解酶的作用底物会影响表达另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x这样的序列x任何氨基酸因为这些序列容易受到容酶体的切割而且目的蛋白末端最好是

alaaspvalser这样的氨基酸。除此之外许多高AT含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录也需要多加注意。第二步就是将线性化的DNA转化入Pichia酵母中。XiangYangEasySelect试剂盒准备了三种菌株X33GS115和KM71H。我倾向于选择X33因为这个菌株转化率和表达量相对而言较高如果你有电转仪

electroporator可以尝试一下。如果没有的话EasySelect也准备了化学转化试剂——EasyCompTransformation但是由于转化率的缘故我建议使用电转仪。leslie在得到了正确的序列之后就可以准备转化毕赤酵母了试剂盒携带有的是X-33GS115和KM71H这三种毕赤酵母另外常用的还有SMD1168每种酵母的特点有些不尽相同Manual上写的很清楚其中X-33由于是野生型因此耐受性比较好如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌而GS115与X33一样都是属于MUT表现型也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长但是据说会对外源基因表达有影响KM71是MUT-型