内容发布更新时间 : 2024/11/8 6:52:17星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。
TCID50测定
50％组织细胞感染量(50％Tissue culture infection dose, TCID50)是指能使半数单层细胞管(孔)出现细胞病变的病毒稀释度。用此方法可以估计病毒感染性的强弱及病毒的含量，但不能准确测定感染性病毒颗粒的多少。 TCID50与 PFU换算:PFUs＝0.7×TCID50的滴度（TCID50法测到的滴度值比标准空斑法高0.7；PFU：蚀斑形成单位，plaque forming unit）。感染性滴度的单位一般表示为PFU/ml。由于测定pfu往往重复性较差，因此近些年许多研究又开始采用TCID50方法来计算病毒的感染单位。因此建议也可使用TCID50法。 【实验材料】
1． 已长成单层的MDCK细胞的96微孔培养板 2． 甲型H1N1病毒液
3． 病毒稀释液（含1.0μg/mlTPCK胰酶的无血清DMEM；注：除了H5高致病型流感病毒稀释时用无血清DMEM外，其它亚型的流感病毒稀释时都用含1.0μg/ml胰酶的无血清DMEM。有时H5型也加。加入胰酶的作用：使HA解离为发挥活性的形式：HA1和HA0。这里用的胰酶是实验室专门配制的，不同于传细胞用的胰酶。）注：TPCK胰酶：原始浓度100μg/ml。 4．灭菌PBS、二氧化碳（CO2）培养箱、倒置显微镜等 【实验步骤】
1． 取无菌EP管10支，各管分别加病毒稀释液0.9 mL，然后向第一管加甲型H1N1病毒液0.1mL，反复混合3次，用另一新吸管从第一管内吸液0.1 mL加入至第二管内，反复混合3次，再换一新吸管，从第二管吸液0.1 mL
加入第三管内，反复混合3次。以此类推将待测的甲型H1N1病毒液作连续10倍稀释，使病毒稀释度为10，10，10……10
－1
－2
－3
－11
等。
2． 吸弃微孔板各孔培养液，用灭菌PBS洗微孔板2次。用微量移液器将每个稀释度的甲型H1N1病毒液依次对号加入各个微孔中，每孔0.1mL，细胞对照不加病毒液，只加等体积病毒稀释液，置37℃ CO2培养箱中培养。 3． 于培养后72h，在倒置显微镜下观察细胞病变情况。
4. 通常CPE难以观察，以做血凝试验的结果来计算TCID50。具体做法：于
培养后72h，将96孔板置于-40℃冷冻，然后将96孔板放于37℃CO2培养箱中解冻。解冻后从96孔板中，每孔吸50ul（或30ul或40ul均可）对应加到血凝板中，然后再向每孔中加入等体积的红细胞，置37℃烘箱中约20min后观察血凝情况，记录血凝价。 （1.提前一天或12h用MDCK细胞铺96孔板； 2.待细胞长至70%左右时，用DMEM洗2遍；
3.将稀释好的病毒接种到96孔板中，每一稀释度接种一纵排共8孔，每孔接种100ul；
4.逐日观察并记录结果，一般需要观察2-3天。）
实验结果：测定的是H5N1黄梅的毒，误用了含1.0μg/mlTPCK胰酶的无血清DMEM。稀释度从10-10每孔均有血凝。稀释度10和10均有1孔未发生血凝，即有7孔发生了血凝。稀释度10有1孔发生血凝。 按Reed-Muench两氏法： 病毒液 CPE孔 无CPE 累计 稀释度 （即血凝孔） 孔数
CPE孔数 无CPE孔数
-1
10
8 0 47 0
出现CPE孔所
占的比例（%）
100(47/47)
-7
-1
-4
-5
-6
10 10 10 10 10 10 10
-8-7-6-5-4-3-2 8 8 8 7 7 1 0
0 0 0 1 1 7 8
39 0 31 0 23 0 15 1 8 2 1 9
0 17
100(39/39) 100(31/31) 100(23/23) 93.8(15/16) 80(8/10) 10(1/10)
0(0/17)
距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）
＝（80-50）/（80-10） ＝ 0.43
lgTCID50=距离此例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数 =0.43×(-1)+(-6) =-6.43 TCID50=10
-6.43
／0.1ml
注： 0.1ml表示在96孔板中每孔接入0.1ml即100ul病毒液。 结果表明：此病毒的10
-6.43
的浓度（即1∶10
6.43
）以0.1 mL接种一组细胞孔后，
使50%细胞感染，即有50%细胞病变的可能性，0.1 mL中含1个TCID50。
按Karber法算得：
lgTCID50=-1-[1×4+(7/8)×2+(1/8)-0.5]=-6.375
TCID50=10
-6.375
／0.1ml
一般取前一种方法计算的结果。