《分子生物学》教案 下载本文

内容发布更新时间 : 2024/3/29 17:47:19星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

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《分子生物学》教案

E DNA 复制 教学目的和要求

1 理解DNA复制的半保留机制和半不连续复制

2 掌握细菌DNA复制过程及有重要作用的酶和蛋白质 3了解细胞周期

4 了解真核生物DNA复制的特点 E1 DNA复制概述

半保留机制 DNA两条亲代链分别作为模板催化新生子链的合成,新生DNA的一条链是原来的旧链,另一条是新合成的,为半保留复制。Meselson 和 Stahl (1958年)用实验证明了该机制(见教材P71)。亲代链分开及新生DNA开始复制处称为复制叉。DNA合成的底物是脱氧核苷三磷酸(dNTP ):dATP dGTP 、 dCTP 、 dTTP 。合成的能量来自 dNTP的水解。

复制子、复制起始与终点 以单一单位复制的任一段DNA都称为复制子。每个复制子都有固定的起始点,原核生物许多病毒的DNA 呈环形,为单一复制子,通常两个复制叉从一个起始点向两个方向复制,复制的起始和细胞生长周期调节都在起始点处调节。真核生物的线性染色体由多复制子构成,每个复制子都有自己的起始点,起始点在最初解链处富含AT序列,它比富含GC的起始点更易解链。

半不连续复制 由于DNA新链合成只允许以5/→3/ 方向 进行,而两条亲本链反向平行,因而一条新链从起始点按 5/→3/ 方向连续合成(前导链),另一条新链(后随链)从复制叉开始按 5/→3/ 方向先合成一些短的DNA片段(冈崎片段),再由连接酶连成一条连续的DNA。即前导链连续合成为长链,后随链则是间断合成的,这种合成方式为半不连续复制。

RNA引导 在每一片段的5/ 端先合成一小段RNA(引物),引导DNA合成。 E2 细菌的DNA复制

起始 E.coli的起始点位于遗传基因座 oriC,大肠杆菌编码的蛋白 DnaA首先识别和结合于 oriC的9bp重复序列形成复合物,约45bp成为单链, DnaB进入,它是DNA解旋酶,利用ATP水解产生的能量解开双链DNA,形成的单链泡被单链结合蛋白 Ssb所覆盖。DNA引发酶结合到DNA上并合成引物RNA。

解旋 DNA解旋酶沿模板链前进,打开双螺旋使复制顺利进行,在闭环DNA中复制叉处解旋所形成的正超螺旋可通过Ⅱ型拓扑异构酶即DNA旋转酶的作用而释放。

延伸 DNA聚合酶Ⅲ的全酶二聚体引发体和DNA解旋酶结合成复合体(复制体),以每秒900bp的速率合成DNA。引发体含有 DnaB解旋酶和DNA引物酶,在后续链上间断合成RNA引物。 DNA聚合酶Ⅲ催化合成DNA,该酶含有聚合酶α亚基和一个3/ →5/外切核酸酶ε亚基。DNA聚合酶Ⅰ负责切除引物并填补缺口,该酶具有5/ → 3/ 聚合酶、5/ → 3/ 外切核酸酶及3/ →5/校正外切核酸酶活性。DNA连接酶填补片段间的缺口。

终止与分离 两个复制叉在 oriC约1800的对面相遇。该区域有终止子位点,它们与 DnaB抑制剂(tus基因的产物)结合,阻止复制叉移动。复制结束后两个相扣的子链DNA由拓扑异构酶Ⅳ(一种Ⅱ型拓扑异构酶)解联,分配到两个子细胞。 E3 细胞周期

细胞周期 细胞分裂为两个子细胞的全部过程为细胞周期,它包括DNA的复制和细胞分裂。细胞周期分4个时期:G1期—细胞为复制作准备;S期—DNA复制;G2期—S期后有

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丝分裂前的短暂期;有丝分裂期—染色体对等分配到两个子细胞,它又有前、中、后期之分。G1 、S、G2 共同组成间期。有丝分裂后,增殖的细胞进入下一个细胞周期的G1期,也可脱离细胞周期进入非增殖的休眠状态G0期(沉默期)。

检验点及其调控 在G1期有决定细胞进入下一个分裂周期的限制点(R点),细胞分裂周期起始还需促细胞分裂原,若细胞在到达R点之前缺乏促细胞分裂原,细胞将重进G0期。细胞周期中终止细胞分裂的那些点叫检验点,它在间歇期发生以保证细胞分裂之前完成DNA复制。

细胞周期蛋白和CDK 蛋白磷酸化是调控细胞周期进程的一个主要机制,由一个调节亚基(细胞周期蛋白)和依赖细胞周期蛋白的激酶(CDK)来完成,细胞周期蛋白—CDK复合物决定将被磷酸化的目标蛋白。

E2F和RB的调控 由G1期进入S期主要依靠对E2F这一转录因子的激活,E2F的活性又受与其结合的蛋白RB的抑制,在G1中后期,细胞周期蛋白—CDK复合物使RB磷酸化从而释放E2F进而激活转录。

细胞周期的激活、抑制和癌症 小的抑制蛋白如CIP蛋白和INK4蛋白可通过抑制细胞周期蛋白—CDK复合物的活性来延迟细胞周期的进程。

细胞周期与癌症间有着根本的联系,G1到S期的过渡受到原癌基因和抑癌蛋白的调控。B细胞的癌变与细胞周期蛋白D1基因的过表达相关。人类癌症中两个重要的抑癌基因产物—抑癌蛋白RB和P53均与细胞周期调控密切相关,RB调控E2F的活性,当DNA损伤时,P53诱导P21 WAF1/CIP1的合成。 E4 真核生物的DNA 复制

实验系统 仅有400个复制子的酵母,更为简单的猿猴病毒(SV40)病毒都是很好的模型。非洲爪蟾卵提取物广泛用于外加DNA或整个细胞核的复制。

起始点和起始 约20—50个复制子串联成簇在S期同时开始复制,常染色质先复制,其次为异染色质,最后是着丝粒和端粒。酵母的起始点都有一个11bp长的保守序列(自动复制序列ARS),它可结合起始点识别复合体(ORC),被CDK激活后引导DNA复制。每个复制子仅起始一次,特许因子在作用后失活能防止复制的再次起始。

复制叉 真核生物复制叉移动速度为每秒50bp,该过程需要解旋酶、单链结合蛋白(复制蛋白A)和3种DNA聚合酶。聚合酶α引发复制的起始,聚合酶δ延伸前导链,聚合酶ε完成后续链的复制。

DNA及复制所需的蛋白质均固定在核基质上。

端粒的复制 真核染色体末端(端粒)由多个简单重复序列构成,不带遗传信息,且3/端突出于5/端 以防止半不连续复制不能复制线性染色体末端而造成遗传信息的丢失。端粒酶负责端粒DNA的复制,它带有与端粒重复序列互补的RNA分子。该酶在体细胞中处于抑制状态,但在许多癌细胞中处于激活状态。

F DNA损伤 、修复与重组 教学目的和要求

1 了解突变的种类和产生的因素 2 理解DNA复制忠实性的机制 3 掌握DNA修复的机制

4 掌握DNA重组的方式及原理 F1 诱变

突变 指DNA碱基序列发生的永久的可遗传的改变。一个单一碱基的改变为点突变,它包括转换(嘌呤与嘌呤,嘧啶与嘧啶间的互换)或颠换(嘌呤与嘧啶间的互换)。如果点突变

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发生在DNA的非编码区、非调节区或密码子的第3个碱基,它不会影响渗入蛋白质中的氨基酸,为沉默突变;如果发生氨基酸的改变,则为错义突变。形成新的终止密码的突变为无义突变,产生截短的蛋白质产物。一个或多个碱基的增加或丢失,会引起移码突变。群体中许多沉默突变及非致死性突变的积累会产生遗传多态性。

复制忠实性 复制的精确性有3种机制:互补碱基配对原则(模板链和进入核苷酸在DNA聚合酶的作用位点正确配对);聚合酶的3/→5/外切酶活性有校对功能,它能回走从3/端切掉错配核苷酸,引物是DNA聚合酶发挥自我校正功能的必要条件;逃脱校对的错误可被错配修复机制所纠正。

诱变剂 常见的物理诱变剂为紫外线,它引起相邻嘧啶核苷酸产生嘧啶二聚体。化学诱变剂种类很多,碱基类似物可改变碱基配对特性,诱发直接突变(如5—溴尿嘧啶是胸腺嘧啶的类似物)。亚硝酸使胞嘧啶脱氨变成尿嘧啶,引起复制中A—T向G—C转化。烷化剂能在DNA不同位置加上烷基,造成碱基脱落,经修复才能防止DNA损伤,细胞对损伤的处理有可能会由于间接诱变而导致突变。

直接诱变和间接诱变 DNA中存在稳定的、配对特性发生改变的碱基而导致的突变为直接诱变;在有些情况下,一些损伤DNA聚合酶为了保证染色体的完整性在损伤对应的位点上插入错误的碱基,导致间接诱变;突变发生在损伤的位点上为定点突变,发生在其它位点为非定点突变。原核生物中转移损伤DNA合成属于对DNA损伤的SOS反应(有时也叫“易错修复”)

F2 DNA损伤

碱基的损伤和丢失 DNA的一些损伤是自发的,如胞嘧啶会自发水解脱氨变为尿嘧啶,它会在接下来的复制中与腺嘌呤配对。生理温度下,哺乳动物的基因组每天约失去10000嘌呤和几百个嘧啶。许多已改变的碱基会被专一性的DNA糖基化酶所除去,形成无嘌呤和无嘧啶位点或AP位点。

氧化性损伤 自由基可攻击DNA,产生氧化产物造成氧化损伤

烷基化 烷化剂为亲电化学试剂,可将烷基加到核酸的各种位点,导致DNA损伤。有些是致死性的,多数导致间接诱变损伤。 聚化加合物 紫外线使相邻嘧啶,尤其是胸腺嘧啶形成环丁烷嘧啶二聚体;煤焦油中的苯并芘在肝脏产生的一种产物可与鸟嘌呤残基共价结合;芳香族烷化剂、黄曲霉毒素B1均可与DNA共价结合。 F3 DNA修复

光复活 DNA中的嘧啶二聚体可通过可见光的光解作用而恢复为单体,催化此过程的酶是DNA光解酶(光复活酶)。E.coli的光解酶有两个发色团:蝶呤和FAD。这是一种无差错的“直接修复”。

烷基转移酶 该酶可直接从突变的O6—烷基鸟嘌呤上除去烷基,酶作用后即失活。它也属于无差错直接修复。

切除修复 为普遍的无差错的修复机制。有两种形式:核苷酸切除修复(如E.coli中的UvrABC内切核酸酶识别并切除嘧啶二聚体和其他大块损伤,缺口可由DNA聚合酶Ⅰ和连接酶填补);碱基切除修复(专一的DNA糖基化酶识别修饰碱基,切除修饰碱基与糖基间的N—糖苷键,留下一个脱嘌呤或脱嘧啶的AP位点,AP内切核酸酶在该位点切开DNA。 错配修复 是一种特殊的切除修复,它是按模板的遗传信息来修复错配碱基的,因此修复时首先要区别模板链和新合成的DNA链。它通过碱基的甲基化来实现的。大肠杆菌DNA的5/—GATC序列中A的N6都是甲基化的(Dam甲基化酶负责),复制后的一个短暂时间内,新合成链的GATC中的A 未被甲基化,故子代DNA暂时是半甲基化的,这是识别的基础。错配的碱基被MutS和 MutL组合的复合体识别并与之结合,再与 MutH内切核酸酶结合,